一例规模化猪场腹泻病因探究
2017年9月份江苏某猪场发生新生仔猪群体性腹泻，为查明造成腹泻流行的病原，本研究采用实验室PCR诊断技术，经过RNA的抽提、RT-PCR和电泳等步骤，对96份腹泻仔猪的粪便样品分别进行猪流行性腹泻病毒（PEDV）、轮状病毒(RV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)的分子生物学检测，结果显示全部为阴性。后续又采集该猪场两只腹泻仔猪的小肠样品，通过PCR诊断技术，检测为PEDV阳性，但并未检测到其他病毒。进一步，本研究通过对代表性PEDV基因序列的测序比对，分析了该猪场PEDV流行株的遗传变异情况，结果表明该猪场当前流行的PEDV为变异株。综合以上研究结果，本研究旨在为该猪场提供更加准确的防治措施，避免经济损失的发生。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 材料 4
1.2方法 4
1.2.1病料处理 4
1.2.2 PCR鉴定及序列分析 5
2 结果与分析7
2.1腹泻病原的RTPCR鉴定结果 7
2.2 样品PEDV的S1基因的遗传变异分析8
3 讨论10
3.1 腹泻病原的RTPCR鉴定结果讨论10
3.2 该猪场PEDV发病原因分析及防控11
3.3 我国当前猪腹泻病因分析及研究进展11
3.4 关于PEDV的讨论12
致谢 12
参考文献 12
一例规模化猪场腹泻病因探究
引言
引言
猪腹泻是造成我国当前养猪业经济损失惨重的重要原因之一，导致猪腹泻的病因多种多样，包括病毒、细菌或寄生虫的感染，日常管理不善，不良环境的应激效应和营养全价水平低等，这些因素均可诱发猪腹泻的发生[1]。临诊经验显示，导致猪腹泻病因是复杂的，常常为上述几种因素共同作用的结果[1]。这几种病因中，细菌性感染和病毒性感染是引起猪腹泻的主要因素[1]。同时，各种病因间又相互联系，互为因果。因此，猪腹泻常呈多重或交叉感染[1]。
近几年，伴随我国养猪业的迅猛发 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
展，猪腹泻病在我国已呈常态化发病，一年四季均有猪腹泻病的发生，冬春季节和59月为每年的高发时间。临床上，对腹泻病料检测结果统计显示，各类病毒中检出率最高的是猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus ，PEDV）为82.1%，其次是轮状病毒（rotavirus，RV）为1.9%及传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus ，TGEV）为1.1%。
猪流行性腹泻是由PEDV引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以呕吐和腹泻为基本特征，各日龄猪均易感，新生仔猪发病最严重[2]。其中哺乳仔猪的发病率和死亡率较高，尤其是7日龄以内的哺乳仔猪，感染后死亡率可达100 %[3] 。20世纪70年代，英国和比利时各自报道了该病的发生[45]，随后该病在世界上多个主要养猪国家相继暴发和流行[6]，近年来亚洲一些国家如泰国、韩国、越南和中国多次报道了PEDV变异株的发生和流行[79] 。
PEDV归类于套式病毒目( Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、甲型冠状病毒属(Alacoronavirus ) [1011]。PEDV为有囊膜且基因组不分节段的单股正链RNA病毒，其基因组大小约为28kb，编码7个开放阅读框(ORFs)，依次包括复制酶(ORFIa, ORF1ab)，纤突糖蛋白(Spike, S），辅助蛋白（ORF3），次要囊膜蛋白(Envelope, E )，主要囊膜蛋白(Membrane, M)，以及核衣壳蛋白(Nueleoeapsid ,N) [1011] 。PEDV S基因分为S1和S2 两部分，S1 区域变异较大，S2 区域相对保守[14] 。S 蛋白为Ⅰ型跨膜蛋白，位于病毒粒子的表面，它在诱导感染宿主中和抗体的产生、与特异性受体的结合及细胞膜融合方面发挥着十分重要的作用[1213] 。
2017年9月，江苏某猪场发生新生仔猪群体性腹泻，发病仔猪日龄集中于110日龄，发病率约50%，死亡率约25%。临床症状表现为：开始发生于仔猪，呈流行性发病，表现为粪便稀如水样，灰黄色或灰色；食欲下降，体重减轻；严重的引起死亡。随后母猪也开始发病，但未引起死亡，通常发病后几天即可痊愈。仔猪剖检可见病变主要集中在小肠，可见小肠水肿，充满淡黄色液体，肠壁变薄；肺部存在阴影区域等。因此，本研究采取仔猪粪便和小肠组织样品，通过实验室PCR诊断技术分别检测样品中是否存在PEDV、RV和TGEV。检测结果为PEDV阳性，RV和TGEV阴性。同时，本研究还对样品中PEDV流行株的部分S1基因进行克隆测序以及遗传进化分析，最终确定了该猪场PEDV的流行变异情况，为该猪场防控PEDV提供了一定依据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 病料
样品收集自2017年9月份江苏某规模化猪场流行性腹泻发病猪， 采集自江苏盐城，采集的样品包括发病仔猪粪便样品96份和小肠样品2份，发病母猪的乳样6份，均由大学动物医学院保存。
1．1．2 主要试剂及仪器
1.1.2.1 主要试剂 Prime star As premix、DEPC水和Trizol购自TaKaRa公司；反转录试剂盒购自诺唯赞生物公司；氯仿、异丙醇和无水乙醇均为国产分析纯。
1.1..2.2 仪器与器材
仪器：高速冷冻离心机为Eppendorff 公司产品；PCR 仪为TAKARA公司产品。凝胶成像仪为 上海天能公司产品；电泳仪和电泳槽为北京六一仪器厂产品。
器材: 1.5mlEP管；PCR管；无RNA酶的大、中、小枪头；各种型号的移液枪。
1.1.3 引物 根据PEDV、TGEV和RV的全基因组序列设计三对引物，分别标记为PEDV F、PEDV R；TGEV F、TGEV R；RVF、RVR。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言 3
1 材料与方法 4
1.1 材料 4
1.2方法 4
1.2.1病料处理 4
1.2.2 PCR鉴定及序列分析 5
2 结果与分析7
2.1腹泻病原的RTPCR鉴定结果 7
2.2 样品PEDV的S1基因的遗传变异分析8
3 讨论10
3.1 腹泻病原的RTPCR鉴定结果讨论10
3.2 该猪场PEDV发病原因分析及防控11
3.3 我国当前猪腹泻病因分析及研究进展11
3.4 关于PEDV的讨论12
致谢 12
参考文献 12
一例规模化猪场腹泻病因探究
引言
引言
猪腹泻是造成我国当前养猪业经济损失惨重的重要原因之一，导致猪腹泻的病因多种多样，包括病毒、细菌或寄生虫的感染，日常管理不善，不良环境的应激效应和营养全价水平低等，这些因素均可诱发猪腹泻的发生[1]。临诊经验显示，导致猪腹泻病因是复杂的，常常为上述几种因素共同作用的结果[1]。这几种病因中，细菌性感染和病毒性感染是引起猪腹泻的主要因素[1]。同时，各种病因间又相互联系，互为因果。因此，猪腹泻常呈多重或交叉感染[1]。
近几年，伴随我国养猪业的迅猛发 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
展，猪腹泻病在我国已呈常态化发病，一年四季均有猪腹泻病的发生，冬春季节和59月为每年的高发时间。临床上，对腹泻病料检测结果统计显示，各类病毒中检出率最高的是猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus ，PEDV）为82.1%，其次是轮状病毒（rotavirus，RV）为1.9%及传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus ，TGEV）为1.1%。
猪流行性腹泻是由PEDV引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，以呕吐和腹泻为基本特征，各日龄猪均易感，新生仔猪发病最严重[2]。其中哺乳仔猪的发病率和死亡率较高，尤其是7日龄以内的哺乳仔猪，感染后死亡率可达100 %[3] 。20世纪70年代，英国和比利时各自报道了该病的发生[45]，随后该病在世界上多个主要养猪国家相继暴发和流行[6]，近年来亚洲一些国家如泰国、韩国、越南和中国多次报道了PEDV变异株的发生和流行[79] 。
PEDV归类于套式病毒目( Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、甲型冠状病毒属(Alacoronavirus ) [1011]。PEDV为有囊膜且基因组不分节段的单股正链RNA病毒，其基因组大小约为28kb，编码7个开放阅读框(ORFs)，依次包括复制酶(ORFIa, ORF1ab)，纤突糖蛋白(Spike, S），辅助蛋白（ORF3），次要囊膜蛋白(Envelope, E )，主要囊膜蛋白(Membrane, M)，以及核衣壳蛋白(Nueleoeapsid ,N) [1011] 。PEDV S基因分为S1和S2 两部分，S1 区域变异较大，S2 区域相对保守[14] 。S 蛋白为Ⅰ型跨膜蛋白，位于病毒粒子的表面，它在诱导感染宿主中和抗体的产生、与特异性受体的结合及细胞膜融合方面发挥着十分重要的作用[1213] 。
2017年9月，江苏某猪场发生新生仔猪群体性腹泻，发病仔猪日龄集中于110日龄，发病率约50%，死亡率约25%。临床症状表现为：开始发生于仔猪，呈流行性发病，表现为粪便稀如水样，灰黄色或灰色；食欲下降，体重减轻；严重的引起死亡。随后母猪也开始发病，但未引起死亡，通常发病后几天即可痊愈。仔猪剖检可见病变主要集中在小肠，可见小肠水肿，充满淡黄色液体，肠壁变薄；肺部存在阴影区域等。因此，本研究采取仔猪粪便和小肠组织样品，通过实验室PCR诊断技术分别检测样品中是否存在PEDV、RV和TGEV。检测结果为PEDV阳性，RV和TGEV阴性。同时，本研究还对样品中PEDV流行株的部分S1基因进行克隆测序以及遗传进化分析，最终确定了该猪场PEDV的流行变异情况，为该猪场防控PEDV提供了一定依据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 病料
样品收集自2017年9月份江苏某规模化猪场流行性腹泻发病猪， 采集自江苏盐城，采集的样品包括发病仔猪粪便样品96份和小肠样品2份，发病母猪的乳样6份，均由大学动物医学院保存。
1．1．2 主要试剂及仪器
1.1.2.1 主要试剂 Prime star As premix、DEPC水和Trizol购自TaKaRa公司；反转录试剂盒购自诺唯赞生物公司；氯仿、异丙醇和无水乙醇均为国产分析纯。
1.1..2.2 仪器与器材
仪器：高速冷冻离心机为Eppendorff 公司产品；PCR 仪为TAKARA公司产品。凝胶成像仪为 上海天能公司产品；电泳仪和电泳槽为北京六一仪器厂产品。
器材: 1.5mlEP管；PCR管；无RNA酶的大、中、小枪头；各种型号的移液枪。
1.1.3 引物 根据PEDV、TGEV和RV的全基因组序列设计三对引物，分别标记为PEDV F、PEDV R；TGEV F、TGEV R；RVF、RVR。
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