克隆山羊成纤维细胞生物学特性及印记基因甲基化分析
【目的】本试验通过对克隆山羊成纤维细胞的生物学特性及甲基化水平进行分析，研究克隆山羊成纤维细胞发生的变化，以期研究体细胞核移植对克隆山羊印记基因甲基化的影响。【方法】奶山羊成纤维细胞及克隆山羊成纤维细胞培养至第五代，血清饥饿处理3天后进行1）绘制细胞增殖曲线，利用流式细胞仪分析细胞凋亡；2）利用实时荧光定量PCR分析Tets、Dnmts、H19、IGF2、IGF2R及细胞凋亡相关基因的表达水平；3）利用亚硫酸氢盐测序方法对H19，IGF2R 差异甲基化区域进行甲基化分析。【结果】克隆山羊成纤维细胞与奶山羊成纤维细胞相比细胞增殖曲线呈典型“S”型，增殖能力无明显差异，但是凋亡率显著增高（P< 0.01）；H19（P< 0.05）和IGF2（P< 0.01）的表达水平显著降低，IGF2R的表达水平则没有显著性变化；H19甲基化水平显著升高（68.8% VS.84.0%，P< 0.05），IGF2R甲基化水平显著降低（79.5% VS.46.5%，P< 0.01）；Tet1（P< 0.05）、Tet2（P< 0.05）和Dnmt1（P< 0.01）、Dnmt3b（P< 0.01）的表达水平均显著降低，Tet3和Dnmt3a的表达水平则无显著性变化。【结论】克隆山羊成纤维细胞凋亡率有所提高，印记基因甲基化异常，部分印记基因的表达也有所异常。这可能与体细胞核移植过程中供体细胞的不完全重编程有关，有待进一步研究。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 3
1．1 试验材料 3
1．2 试验方法 3
1．2．1 细胞培养 3
1．2．2 细胞增殖曲线绘制及流式细胞仪分析细胞凋亡 3
1．2．3 实时荧光定量PCR 3
1．2．4 DNA甲基化分析 5
2 结果与分析 7
2．1 奶山羊成纤维细胞，克隆山羊成纤维细胞增殖和凋亡结果分析 7
2．2 基因表达水平分析 8
2．2．1 凋亡相关基因表达水平分析 8
2．2．2 印记基因表达水平分析 8
2．2．3 甲
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
基化基因表达水平分析 8
2．3 H19，IGF2R甲基化结果分析 9
3 讨论 10
致谢 11
参考文献 12
克隆山羊成纤维细胞
生物学特性及印记基因甲基化分析
引言
引言
体细胞核移植技术（Somatic cell nuclear transfer，SCNT）作为一种无性繁殖手段受到广泛关注，在生命科学、畜牧生产、珍稀动物保护、医疗卫生和生物制药等方面日益显示出巨大的发展潜力。在畜牧生产中，体细胞核移植技术不但可以大量制备出人类所需要的优良个体，缩短育种时间，节省物力，还可以用于转基因动物的制备和研究，培育出符合人类需求的转基因家畜，为家畜育种改良提供了一条重要的途径。转基因克隆动物可以用来做SCNT的供体动物，产生下一代克隆动物[1, 2]。但是克隆动物的效率极为低下，直接使用克隆家畜的组织进行相关研究是不现实的。在组织向细胞培养的过程中，DNA甲基化水平并不发生改变[3]，因此，体外培养耳成纤维细胞是研究表观遗传重组错误的理想方法。
DNA甲基化是研究最为广泛的表观遗传修饰。在哺乳动物中，DNA甲基化(5methylcytosine ,5mC) 主要发生在CpG岛上，是一种重要的表观遗传修饰，与基因的转录和印记[4, 5]，X染色体失活以及转座元件的抑制密切相关[6]。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，Dnmt）调控的[5]，在DNA复制过程中，DNA甲基化最初由Dnmt3a和Dnmt3b建立，并由Dnmt1维持[4, 7, 8]。而最近刚的研究表明Tet（Ten Eleven Translocation, Tet）蛋白具有使5mC羟化反应生成5hmC（5hydroxymethylcytosine，5hmC）的酶活性，表明DNA甲基化可能是动态变化的[912]。
印记基因在一方亲本来源的同源基因表达，而来自另一亲本的基因不表达。其在胚胎的发育及个体生长过程中具有重要作用。印记基因H19、IGF2及其受体IGF2R近年来研究广泛，对于正常胚胎的发育有至关重要的作用。
H19为父源印记母源表达基因，其在胚胎组织中表达水平很高，出生后各组织的表达水平则明显受到抑制，其印记功能的紊乱会导致多种发育异常甚至死胎[13, 14]。IGF2为母源印记父源表达基因，亦参与胚胎生长发育调控，不但在胚胎时期表达水平较高，机体出生后也会继续表达[15, 16]。H19和IGF2在同一条染色体上，IGF2位于H19上游，中间间隔一个可以调控两个基因的DMR。在母源染色体中，此DMR未甲基化，使IGF2基因下游增强子不能发挥作用，进而IGF2不能正常表达，促进H19的正常表达；在父源染色体中，此DMR甲基化，使H19基因启动子不能发挥作用，进而H19沉默[1719]。IGF2R为父源印记母源表达的基因，在IGF2循环中起作用，对于胚胎的生长发育有重要作用[20]。
印记基因的正常表达是由差异甲基化区域（differentially methylated region，DMR）的DNA甲基化所控制。印记基因DMR异常的DNA甲基化可能会导致等位基因的表达或沉默[21]。基因表达异常、印记基因甲基化及表达水平异常已在很多物种的克隆胚胎上有所研究：在克隆猪胚胎的研究中发现，克隆胚胎胚外组织转录相关基因表达水平显著高于普通猪胚胎[21]；在克隆鼠胚胎中，印记基因mir127甲基化水平显著提高，其表达水平则显著降低[22]；在核移植牛胚胎的研究中发现SCNT胚胎的IGF2表达水平高于体外受精胚胎，IGF2R表达水平则没有明显变化[23]；流产的克隆牛胚胎组织中Peg3、Xist、Peg10三个印记基因甲基化水平个体差异较大[24]。克隆后代的体细胞具有作为供体细胞的潜能，但是在克隆后代体细胞中DNA甲基化等表观遗传修饰鲜有报道。因此本试验以克隆山羊成纤维细胞（cloned goat fibroblast cells，CFC）为研究对象，分析了克隆山羊成纤维细胞的增殖、凋亡等生物学特性，并利用荧光定量PCR分析表观遗传相关基因Tets、Dnmts及印记基因H19、IGF2和IGF2R的表达水平，最后用亚硫酸盐测序分析H19和IGF2R的DMR甲基化状态，以期研究SCNT对于克隆山羊印记基因甲基化的影响。
1 材料与方法
1．1 试验材料
奶山羊和体细胞核移植奶山羊耳成纤维细胞系为本实验室保存。
1．2 试验方法
1．2．1 细胞培养
冻存的细胞从液氮取出后，立即放入37℃水浴锅，快速摇动使其融化。以1×105 /ml密度接种于12孔板，每孔加入1ml含1%（V/V）双抗，1%（V/V）谷氨酰胺，10%胎牛血清（FBS，V/V）的DMEM培养液置于37℃，5% CO2，100%湿度培养箱中培养。待细胞（第5代）达到80%汇合度时，以含0.5% FBS的DMEM培养液饥饿处理3天，每天换液。
1．2．2 细胞增殖曲线绘制及流式细胞仪分析细胞凋亡
1．2．2．1 细胞增殖曲线绘制
取第4代细胞，以相同浓度在24孔板中培养，每三天换液，每隔24小时使用胰蛋白酶消化三个孔。使用血球计数板计算细胞密度，持续七天。绘制细胞增殖曲线。
胰蛋白酶消化细胞步骤：
1）使用移液枪吸去含有血清的细胞培养液，并用DPBS清洗2次。
2）加入胰蛋白酶液。置于显微镜下观察，细胞开始变圆立即吸去胰蛋白酶液并加入含有血清的细胞培养液终止消化。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料与方法 3
1．1 试验材料 3
1．2 试验方法 3
1．2．1 细胞培养 3
1．2．2 细胞增殖曲线绘制及流式细胞仪分析细胞凋亡 3
1．2．3 实时荧光定量PCR 3
1．2．4 DNA甲基化分析 5
2 结果与分析 7
2．1 奶山羊成纤维细胞，克隆山羊成纤维细胞增殖和凋亡结果分析 7
2．2 基因表达水平分析 8
2．2．1 凋亡相关基因表达水平分析 8
2．2．2 印记基因表达水平分析 8
2．2．3 甲
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
基化基因表达水平分析 8
2．3 H19，IGF2R甲基化结果分析 9
3 讨论 10
致谢 11
参考文献 12
克隆山羊成纤维细胞
生物学特性及印记基因甲基化分析
引言
引言
体细胞核移植技术（Somatic cell nuclear transfer，SCNT）作为一种无性繁殖手段受到广泛关注，在生命科学、畜牧生产、珍稀动物保护、医疗卫生和生物制药等方面日益显示出巨大的发展潜力。在畜牧生产中，体细胞核移植技术不但可以大量制备出人类所需要的优良个体，缩短育种时间，节省物力，还可以用于转基因动物的制备和研究，培育出符合人类需求的转基因家畜，为家畜育种改良提供了一条重要的途径。转基因克隆动物可以用来做SCNT的供体动物，产生下一代克隆动物[1, 2]。但是克隆动物的效率极为低下，直接使用克隆家畜的组织进行相关研究是不现实的。在组织向细胞培养的过程中，DNA甲基化水平并不发生改变[3]，因此，体外培养耳成纤维细胞是研究表观遗传重组错误的理想方法。
DNA甲基化是研究最为广泛的表观遗传修饰。在哺乳动物中，DNA甲基化(5methylcytosine ,5mC) 主要发生在CpG岛上，是一种重要的表观遗传修饰，与基因的转录和印记[4, 5]，X染色体失活以及转座元件的抑制密切相关[6]。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferases，Dnmt）调控的[5]，在DNA复制过程中，DNA甲基化最初由Dnmt3a和Dnmt3b建立，并由Dnmt1维持[4, 7, 8]。而最近刚的研究表明Tet（Ten Eleven Translocation, Tet）蛋白具有使5mC羟化反应生成5hmC（5hydroxymethylcytosine，5hmC）的酶活性，表明DNA甲基化可能是动态变化的[912]。
印记基因在一方亲本来源的同源基因表达，而来自另一亲本的基因不表达。其在胚胎的发育及个体生长过程中具有重要作用。印记基因H19、IGF2及其受体IGF2R近年来研究广泛，对于正常胚胎的发育有至关重要的作用。
H19为父源印记母源表达基因，其在胚胎组织中表达水平很高，出生后各组织的表达水平则明显受到抑制，其印记功能的紊乱会导致多种发育异常甚至死胎[13, 14]。IGF2为母源印记父源表达基因，亦参与胚胎生长发育调控，不但在胚胎时期表达水平较高，机体出生后也会继续表达[15, 16]。H19和IGF2在同一条染色体上，IGF2位于H19上游，中间间隔一个可以调控两个基因的DMR。在母源染色体中，此DMR未甲基化，使IGF2基因下游增强子不能发挥作用，进而IGF2不能正常表达，促进H19的正常表达；在父源染色体中，此DMR甲基化，使H19基因启动子不能发挥作用，进而H19沉默[1719]。IGF2R为父源印记母源表达的基因，在IGF2循环中起作用，对于胚胎的生长发育有重要作用[20]。
印记基因的正常表达是由差异甲基化区域（differentially methylated region，DMR）的DNA甲基化所控制。印记基因DMR异常的DNA甲基化可能会导致等位基因的表达或沉默[21]。基因表达异常、印记基因甲基化及表达水平异常已在很多物种的克隆胚胎上有所研究：在克隆猪胚胎的研究中发现，克隆胚胎胚外组织转录相关基因表达水平显著高于普通猪胚胎[21]；在克隆鼠胚胎中，印记基因mir127甲基化水平显著提高，其表达水平则显著降低[22]；在核移植牛胚胎的研究中发现SCNT胚胎的IGF2表达水平高于体外受精胚胎，IGF2R表达水平则没有明显变化[23]；流产的克隆牛胚胎组织中Peg3、Xist、Peg10三个印记基因甲基化水平个体差异较大[24]。克隆后代的体细胞具有作为供体细胞的潜能，但是在克隆后代体细胞中DNA甲基化等表观遗传修饰鲜有报道。因此本试验以克隆山羊成纤维细胞（cloned goat fibroblast cells，CFC）为研究对象，分析了克隆山羊成纤维细胞的增殖、凋亡等生物学特性，并利用荧光定量PCR分析表观遗传相关基因Tets、Dnmts及印记基因H19、IGF2和IGF2R的表达水平，最后用亚硫酸盐测序分析H19和IGF2R的DMR甲基化状态，以期研究SCNT对于克隆山羊印记基因甲基化的影响。
1 材料与方法
1．1 试验材料
奶山羊和体细胞核移植奶山羊耳成纤维细胞系为本实验室保存。
1．2 试验方法
1．2．1 细胞培养
冻存的细胞从液氮取出后，立即放入37℃水浴锅，快速摇动使其融化。以1×105 /ml密度接种于12孔板，每孔加入1ml含1%（V/V）双抗，1%（V/V）谷氨酰胺，10%胎牛血清（FBS，V/V）的DMEM培养液置于37℃，5% CO2，100%湿度培养箱中培养。待细胞（第5代）达到80%汇合度时，以含0.5% FBS的DMEM培养液饥饿处理3天，每天换液。
1．2．2 细胞增殖曲线绘制及流式细胞仪分析细胞凋亡
1．2．2．1 细胞增殖曲线绘制
取第4代细胞，以相同浓度在24孔板中培养，每三天换液，每隔24小时使用胰蛋白酶消化三个孔。使用血球计数板计算细胞密度，持续七天。绘制细胞增殖曲线。
胰蛋白酶消化细胞步骤：
1）使用移液枪吸去含有血清的细胞培养液，并用DPBS清洗2次。
2）加入胰蛋白酶液。置于显微镜下观察，细胞开始变圆立即吸去胰蛋白酶液并加入含有血清的细胞培养液终止消化。
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