小反刍兽疫病毒的分离和rtpcr鉴定
近年来我国西北地区开始爆发小反刍兽疫疫情，给养羊业造成了严重的经济损失。本实验对小反刍兽疫病毒（PPRV）的病毒分离和分子鉴定方法进行了初探。将疑似含有小反刍兽疫病毒的病料，进行无菌处理后接种Marc-145细胞，观察到明显的细胞病变后收集病毒，提取RNA，采用一步法RT-PCR对小反刍兽疫病毒的N基因进行检测。将阳性扩增片段进行序列测定和分析，最终确定分离的病毒就是小反刍兽疫病毒。本实验初步证明了一步法RT-PCR可简单快速地鉴定小反刍兽疫病毒。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言（或绪论）2
1 材料与方法3
1.1 材料3
1.1.1 样品3
1.1.2 主要试剂3
1.1.3 主要设备3
1.1.4 细胞与培养3
1.1.5 引物3
1.2 方法4
1.2.1 病毒分离4
1.2.2 病毒RNA的提取4
1.2.3 一步法RTPCR体系的反应条件4
1.2.4 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物5
1.2.5 DNA纯化回收5
2 结果与分析5
2.1 细胞病变观察5
2.2 RTPCR扩增结果6
2.3 RTPCR检测结果6
3 讨论 7
3.1 本实验的研究意义7
3.2 小反刍兽疫的防控7
3.3 实验总结8
致谢8
参考文献8
小反刍兽疫病毒的分离和RTPCR鉴定
引言
小反刍兽疫（Peste des petits ruminants ,PPR），又名小反刍兽伪牛瘟，是由小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus ,PPRV）引起的一种急性病毒性传染病。PPR是OIE规定的A类烈性传染病，我国规定为一类传染疫病，它是一种急性烈性的接触性疾病，主要感染小反刍兽，高度感染山羊，其他野生动物也会发生。该病以突然发热、精神沉郁、眼和鼻排出分泌物、口腔溃疡、 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
呼吸失调、咳嗽、恶臭的腹泻和死亡为特征[1]。
近几年该病在我国的周边国家频频发生，特别是我国也发生小反刍兽疫疫情，2007年7月，我国西藏发生不明山羊疫情，国家外来动物病诊断中心对当地动物疫病控制中心送检病料利用逆转录PCR（RTPCR）等方法证实其为小反刍兽疫病毒。这是我国首例确诊的小反刍兽疫疫情[2]。2013年国家农业部报道新疆多地州发生小反刍兽疫疫情，并呈现由边境逐渐向内传播的趋势[3]。现已严重威胁到小反刍动物的健康，目前我国对小反刍兽疫病毒的研究还处于起步阶段，因此对小反刍兽疫的研究，具有重大的现实意义。小反刍兽疫病毒常用原代细胞有山羊和绵羊胎肾细胞，犊牛肾细胞，羊膜细胞，猴肾细胞进行细胞培养。传代细胞有MDKBC，MS，BHK12，Vero，BSC、Marc145等。一般于6~15天出现细胞病变[4]。小反刍兽疫病毒RTPCR方法是目前世界动物卫生组织规定的检测标准之一[5]。该方法具有高度特异性和敏感性，已广泛用于抗原检测。
在小反刍兽疫病毒检测中常用普通RTPCR以及实时定量PCR方法来检测病毒RNA。N蛋白是组成病毒核衣壳的主要蛋白之一，基于该蛋白发展的诊断技术可以有效的区分PPR和牛瘟[6]。各国研究者先后建立了针对N基因的普通RTPCR方法 [79]。CouacyHyma nn等[10]建立了检测小反刍兽疫病毒的两步法RTPCR方法，在该方法中逆转录和PCR反应分别在不同的管子中进行，但样品转移的污染可能会产生假阳性结果。Balamurugan等[11]建立了检测小反刍兽疫病毒和伪狂犬病毒的一步法多重RTPCR方法，可以在同一个管子中先后进行逆转录和PCR反应，从而简化了操作步骤，减少了可能的污染[12]，同时一次反应就可以区分两种病原。
本实验以小反刍兽疫病毒为研究对象，通过病毒分离和RTPCR的检测，鉴定小反刍兽疫病毒。本实验可为小反刍兽疫的诊断提供有效的依据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 样品
小反刍兽疫疫苗是由新疆天康生物有限公司生产；病料为病畜的淋巴结和脾脏，是2013年在江苏省南通市海安县某养殖场采集。
1．1．2 主要试剂
DNA/RNA共提取试剂盒购自TIANGEN公司；一步法RTPCR的试剂盒是由诺唯赞（Vazyme）生物科技有限公司生产；琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒和DL2000 DNA Marker是由TaKaRa生物有限公司生产。
1．1．3 主要设备
37℃温箱（太仓市实验设备厂）；常规PCR仪（杭州朗基科学仪器有限公司）；微型漩涡混合仪（WH2型，上海沪西分析仪器厂）；微量移液器一套（eppendorf有限公司）；台式高速冷冻离心机（TGL20型，上海赵迪生物科技有限公司）；直流电泳仪（DYYⅢ，北京市六一仪器厂）；超净工作台（苏州仪器四厂）；紫外分光光度计（S51/52型，上海凌光科技有限公司）；无RNA酶的枪头和无RNA酶的1.5ml的离心管。
1．1．4 细胞与培养
Marc145细胞由本实验室保存，细胞培养液为8%小牛血清加上92%DMEM培养基。细胞维持液为1%双抗加上99%DMEM培养基。DMEM培养基购自GIBCO公司。
1．1．5 引物
根据小反刍兽疫病毒 N基因序列设计的一对引物（见表1），预期扩增产物片段大小为350bp。引物由上海生物工程有限公司合成。
表1 RTPCR所用的引物
Table 1 Primers used in RTPCR
引物
序列
纯化方式
PPRN1
5’ TCTCGGAAATCGCCTCACAGACTG3’
PAGE
PPRN2
5’ CCTCCTCCTGGTCCTCCAGAATCT3’
PAGE
1．2 方法
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言（或绪论）2
1 材料与方法3
1.1 材料3
1.1.1 样品3
1.1.2 主要试剂3
1.1.3 主要设备3
1.1.4 细胞与培养3
1.1.5 引物3
1.2 方法4
1.2.1 病毒分离4
1.2.2 病毒RNA的提取4
1.2.3 一步法RTPCR体系的反应条件4
1.2.4 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物5
1.2.5 DNA纯化回收5
2 结果与分析5
2.1 细胞病变观察5
2.2 RTPCR扩增结果6
2.3 RTPCR检测结果6
3 讨论 7
3.1 本实验的研究意义7
3.2 小反刍兽疫的防控7
3.3 实验总结8
致谢8
参考文献8
小反刍兽疫病毒的分离和RTPCR鉴定
引言
小反刍兽疫（Peste des petits ruminants ,PPR），又名小反刍兽伪牛瘟，是由小反刍兽疫病毒（Peste des petits ruminants virus ,PPRV）引起的一种急性病毒性传染病。PPR是OIE规定的A类烈性传染病，我国规定为一类传染疫病，它是一种急性烈性的接触性疾病，主要感染小反刍兽，高度感染山羊，其他野生动物也会发生。该病以突然发热、精神沉郁、眼和鼻排出分泌物、口腔溃疡、 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
呼吸失调、咳嗽、恶臭的腹泻和死亡为特征[1]。
近几年该病在我国的周边国家频频发生，特别是我国也发生小反刍兽疫疫情，2007年7月，我国西藏发生不明山羊疫情，国家外来动物病诊断中心对当地动物疫病控制中心送检病料利用逆转录PCR（RTPCR）等方法证实其为小反刍兽疫病毒。这是我国首例确诊的小反刍兽疫疫情[2]。2013年国家农业部报道新疆多地州发生小反刍兽疫疫情，并呈现由边境逐渐向内传播的趋势[3]。现已严重威胁到小反刍动物的健康，目前我国对小反刍兽疫病毒的研究还处于起步阶段，因此对小反刍兽疫的研究，具有重大的现实意义。小反刍兽疫病毒常用原代细胞有山羊和绵羊胎肾细胞，犊牛肾细胞，羊膜细胞，猴肾细胞进行细胞培养。传代细胞有MDKBC，MS，BHK12，Vero，BSC、Marc145等。一般于6~15天出现细胞病变[4]。小反刍兽疫病毒RTPCR方法是目前世界动物卫生组织规定的检测标准之一[5]。该方法具有高度特异性和敏感性，已广泛用于抗原检测。
在小反刍兽疫病毒检测中常用普通RTPCR以及实时定量PCR方法来检测病毒RNA。N蛋白是组成病毒核衣壳的主要蛋白之一，基于该蛋白发展的诊断技术可以有效的区分PPR和牛瘟[6]。各国研究者先后建立了针对N基因的普通RTPCR方法 [79]。CouacyHyma nn等[10]建立了检测小反刍兽疫病毒的两步法RTPCR方法，在该方法中逆转录和PCR反应分别在不同的管子中进行，但样品转移的污染可能会产生假阳性结果。Balamurugan等[11]建立了检测小反刍兽疫病毒和伪狂犬病毒的一步法多重RTPCR方法，可以在同一个管子中先后进行逆转录和PCR反应，从而简化了操作步骤，减少了可能的污染[12]，同时一次反应就可以区分两种病原。
本实验以小反刍兽疫病毒为研究对象，通过病毒分离和RTPCR的检测，鉴定小反刍兽疫病毒。本实验可为小反刍兽疫的诊断提供有效的依据。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 样品
小反刍兽疫疫苗是由新疆天康生物有限公司生产；病料为病畜的淋巴结和脾脏，是2013年在江苏省南通市海安县某养殖场采集。
1．1．2 主要试剂
DNA/RNA共提取试剂盒购自TIANGEN公司；一步法RTPCR的试剂盒是由诺唯赞（Vazyme）生物科技有限公司生产；琼脂糖凝胶DNA提取试剂盒和DL2000 DNA Marker是由TaKaRa生物有限公司生产。
1．1．3 主要设备
37℃温箱（太仓市实验设备厂）；常规PCR仪（杭州朗基科学仪器有限公司）；微型漩涡混合仪（WH2型，上海沪西分析仪器厂）；微量移液器一套（eppendorf有限公司）；台式高速冷冻离心机（TGL20型，上海赵迪生物科技有限公司）；直流电泳仪（DYYⅢ，北京市六一仪器厂）；超净工作台（苏州仪器四厂）；紫外分光光度计（S51/52型，上海凌光科技有限公司）；无RNA酶的枪头和无RNA酶的1.5ml的离心管。
1．1．4 细胞与培养
Marc145细胞由本实验室保存，细胞培养液为8%小牛血清加上92%DMEM培养基。细胞维持液为1%双抗加上99%DMEM培养基。DMEM培养基购自GIBCO公司。
1．1．5 引物
根据小反刍兽疫病毒 N基因序列设计的一对引物（见表1），预期扩增产物片段大小为350bp。引物由上海生物工程有限公司合成。
表1 RTPCR所用的引物
Table 1 Primers used in RTPCR
引物
序列
纯化方式
PPRN1
5’ TCTCGGAAATCGCCTCACAGACTG3’
PAGE
PPRN2
5’ CCTCCTCCTGGTCCTCCAGAATCT3’
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1．2 方法
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