atp及葡萄糖在猪肺炎支原体感染引起猪喉上皮细胞凋亡中的作用
：猪肺炎支原体（Mhp）果糖二磷酸醛缩酶（FBA）作为糖酵解作用中的关键酶和膜表面蛋白发挥功能，但其具体分子机制尚不清楚。本实验通过离体培养猪喉气管上皮细胞，用不同浓度的葡萄糖和ATP对168L株进行培养并感染猪喉上皮细胞，利用Annexin V/PI双染色法流式细胞仪检测细胞凋亡值。实验结果表明，葡萄糖溶液浓度上升，细胞凋亡量呈增高趋势，并且添加葡萄糖溶液的细胞凋亡量大于未加入葡萄糖溶液的对照组；在不加入猪肺炎支原体168L株时随葡萄糖溶液浓度上升细胞凋亡量明显下降；ATP溶液浓度大于4%时，细胞凋亡量呈下降趋势；在不加入猪肺炎支原体168L株时，添加ATP溶液对细胞凋亡量的影响不是很大。综合以上结果表明葡萄糖溶液和ATP溶液浓度会影响果糖二磷酸醛缩酶所在的糖酵解途径发挥作用，对猪肺炎支原体致病力造成一定的影响。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 Mhp168L 弱毒株的准备2
1.1.2 培养基2
1.1.3 ATP2
1.1.4 葡萄糖2
1.1.5 细胞的培养及传代2
1.2 方法 2
1.2.1 细胞的培养及传代2
1.2.2 ATP的准备3
1.2.3 葡萄糖的准备3
1.2.4 猪支原体168L株的培养及准备3
1.2.5 正式试验阶段3
2 结果与分析4
2.1 实验结果4
2.2 结果分析8
3 讨论 8
致谢9
参考文献9
ATP及葡萄糖在猪肺炎支原体感染引起猪喉上皮细胞凋亡中的作用
引言
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp) 果糖1,6 二磷酸醛缩酶（fructose 1,6bisphosphate aldolase，FBA) 属于Ⅱ类醛缩酶，位于细胞膜表面，其主要功能是作为糖酵解途径的关键酶参与能量代谢，为猪肺炎支原体提供能量。同时，
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
由于支原体缺少水解相应代谢产物的酶，无法及时清除糖酵解时产生的各种自由基和代谢产物，给宿主细胞造成损伤。另一方面，醛缩酶作为支原体表面膜蛋白可能参与病原微生物对宿主细胞的黏附，侵染等致病作用。Mhp 强毒感染可引起的猪气管上皮细胞发生凋亡和氧化应激，可猪肺炎支原体168L弱毒株并不引起类似的病理损伤。研究发现，相比 168L 弱毒株，168强毒株高表达 FBA，且 168L 株的 FBA 基因与 168 株相比发生了突变，提示 168株的致病性可能与 FBA 有关。我们项目组的前期实验也发现人工表达的猪肺炎支原体 FBA 可致培养的猪气管上皮细胞死亡，提示 FBA 具有致病作用。但是在Mhp 致宿主细胞损伤过程中 FBA 的主要作用机制还不清楚。
Ⅱ类果糖二磷酸醛缩酶（Class II fructose 1,6bisphosphate aldolase，FBA)是细菌、真菌和原生动物中作为糖酵解途径中的关键酶[1]，催化裂解 l,6二磷酸D果糖，生成 3磷酸D甘油醛和 a二羟丙酮磷酸[2]，后者通过一系列生化反应为微生物提供能量。糖酵解总方程式为：
1 葡萄糖+2ADP+2Pi+2NAD+——>2丙酮酸 + 2ATP + 2NADH + 2H+ + 2H2O
可被高浓度的ATP所抑制。由此方程式可知在糖酵解过程会产生还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)及 H+，NADH 在后期代谢过程中会产生大量自由基，如O2，H2O2 等[3]，如不及时清除，会对细胞造成损伤。其次，很多报道显示醛缩酶在细菌中可以作为毒力因子参与宿主细胞的黏附或其他致病作用。如在肺炎链球菌中，醛缩酶定位于细菌的表面，可与钙黏蛋白超家族成员中的一个7次跨膜蛋白受体相结合[4]，且是免疫保护性抗原[5]。Tunio SA等[6]发现醛缩酶存在于脑膜炎奈瑟菌的细胞质和细菌外膜上，且脑膜炎奈瑟菌醛缩酶缺失株黏附人脑微血管上皮和人喉癌上皮细胞 HEp2 的能力显著下降，说明醛缩酶在参与脑膜炎奈瑟菌黏附人细胞的过程中起重要作用。白念珠菌菌丝体胞浆内醛缩酶含量丰富，但只在侵袭性感染时释出，是白念珠菌的优势免疫抗原之一[7]，说明醛缩酶在细菌侵袭过程中有一定的作用。de la Paz Santangelo M 等[8]发现在坏死肺中的结核分枝杆菌高表达 FBA，提示 FBA 可能参与了致宿主细胞的损伤。除此之外，猪链球菌醛缩酶也被证明是一个免疫原性膜蛋白[9]。因人和动物没有这类醛缩酶, FBA 已作为新药物靶标用于研发新的抗生素[10]，所以对病原微生物FBA作用机制及糖酵解途径的研究有利于指导临床微生物感染的防治及临床新药物的研发。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 Mhp168L 弱毒株的准备
取对数期的 Mhp168L 弱毒株的培养物，经处理后分小瓶冻干保存，每瓶 1mL。随机取小瓶复苏后测定 CCU，重复三次，取平均值作为复苏后支原体的浓度。每次试验时用 PBS 稀释冻干菌株，12000r/min 离心 30min，取沉淀 PBS 洗涤 1 次， 根据复苏后支原体原始浓度，用 DMEM 维持液重悬，调整菌体滴度至 2.5×107CCU /mL，用于感染试验。
1．1．2 培养基
KM2 培养基： 使用已有江苏省农科院兽医所KM2 培养基；
1640 培养基： 配置5L 1640 培养基于4℃中保存；
1．1．3 ATP
购买商品ATP粉末配置浓度为25%的ATP溶液，4℃保存；实验中终浓度梯度为2%、4%、6%、8%、10%。
1．1．4 葡萄糖
用葡萄糖粉末配置浓度为25%的葡萄糖溶液，4℃保存；实验中终浓度梯度为2%、4%、6%、8%、10%。
1．1．5 猪喉气管上皮细胞
即前期猪喉气管上皮细胞的复苏，培养及传代（详见实验方法）。
1．2 实验方法
1．2．1 细胞的培养及传代
（1）从液氮罐中取出猪喉气管上皮细胞，于60℃温水中水浴约1min；
（2）解冻后的猪喉上皮细胞液用移液器加入细胞瓶内，添加1640培养基，轻轻摇匀，放置于温箱过夜；
（3）第二天早晨，使用显微镜观察，细胞长满80%以上时则可进行传代；
（4）取出胰酶、1640培养基，温箱中进行解冻；并准备三个高压灭菌后的细胞瓶待用；
（5）进入细胞间，穿上消毒防护衣后，用酒精消毒双手，并用酒精棉球擦拭消毒超净台和实验所用材料，点燃酒精灯，将所需实验材料放置于超净台内；
（6）将细胞瓶从温箱中取出，在酒精灯旁拧开瓶口，酒精灯灼烧瓶口，用移液器加入胰酶1ml并润洗10遍；
（7）润洗结束后加2ml胰酶消化，左右晃匀20 次，弃去胰酶，拧上瓶盖放置于温箱进行消化12min；
（8）消化结束后取出取出细胞瓶在酒精灯旁打开，用移液器加入510ml 1640培养基终止消化，吹打清洗细胞瓶底部及瓶壁；（4050次）
（9）用胶头滴管将细胞液分别加入三个新的细胞瓶中，换滴管加1640培养基至约10ml，轻轻摇匀；
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 Mhp168L 弱毒株的准备2
1.1.2 培养基2
1.1.3 ATP2
1.1.4 葡萄糖2
1.1.5 细胞的培养及传代2
1.2 方法 2
1.2.1 细胞的培养及传代2
1.2.2 ATP的准备3
1.2.3 葡萄糖的准备3
1.2.4 猪支原体168L株的培养及准备3
1.2.5 正式试验阶段3
2 结果与分析4
2.1 实验结果4
2.2 结果分析8
3 讨论 8
致谢9
参考文献9
ATP及葡萄糖在猪肺炎支原体感染引起猪喉上皮细胞凋亡中的作用
引言
猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp) 果糖1,6 二磷酸醛缩酶（fructose 1,6bisphosphate aldolase，FBA) 属于Ⅱ类醛缩酶，位于细胞膜表面，其主要功能是作为糖酵解途径的关键酶参与能量代谢，为猪肺炎支原体提供能量。同时，
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
由于支原体缺少水解相应代谢产物的酶，无法及时清除糖酵解时产生的各种自由基和代谢产物，给宿主细胞造成损伤。另一方面，醛缩酶作为支原体表面膜蛋白可能参与病原微生物对宿主细胞的黏附，侵染等致病作用。Mhp 强毒感染可引起的猪气管上皮细胞发生凋亡和氧化应激，可猪肺炎支原体168L弱毒株并不引起类似的病理损伤。研究发现，相比 168L 弱毒株，168强毒株高表达 FBA，且 168L 株的 FBA 基因与 168 株相比发生了突变，提示 168株的致病性可能与 FBA 有关。我们项目组的前期实验也发现人工表达的猪肺炎支原体 FBA 可致培养的猪气管上皮细胞死亡，提示 FBA 具有致病作用。但是在Mhp 致宿主细胞损伤过程中 FBA 的主要作用机制还不清楚。
Ⅱ类果糖二磷酸醛缩酶（Class II fructose 1,6bisphosphate aldolase，FBA)是细菌、真菌和原生动物中作为糖酵解途径中的关键酶[1]，催化裂解 l,6二磷酸D果糖，生成 3磷酸D甘油醛和 a二羟丙酮磷酸[2]，后者通过一系列生化反应为微生物提供能量。糖酵解总方程式为：
1 葡萄糖+2ADP+2Pi+2NAD+——>2丙酮酸 + 2ATP + 2NADH + 2H+ + 2H2O
可被高浓度的ATP所抑制。由此方程式可知在糖酵解过程会产生还原态烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)及 H+，NADH 在后期代谢过程中会产生大量自由基，如O2，H2O2 等[3]，如不及时清除，会对细胞造成损伤。其次，很多报道显示醛缩酶在细菌中可以作为毒力因子参与宿主细胞的黏附或其他致病作用。如在肺炎链球菌中，醛缩酶定位于细菌的表面，可与钙黏蛋白超家族成员中的一个7次跨膜蛋白受体相结合[4]，且是免疫保护性抗原[5]。Tunio SA等[6]发现醛缩酶存在于脑膜炎奈瑟菌的细胞质和细菌外膜上，且脑膜炎奈瑟菌醛缩酶缺失株黏附人脑微血管上皮和人喉癌上皮细胞 HEp2 的能力显著下降，说明醛缩酶在参与脑膜炎奈瑟菌黏附人细胞的过程中起重要作用。白念珠菌菌丝体胞浆内醛缩酶含量丰富，但只在侵袭性感染时释出，是白念珠菌的优势免疫抗原之一[7]，说明醛缩酶在细菌侵袭过程中有一定的作用。de la Paz Santangelo M 等[8]发现在坏死肺中的结核分枝杆菌高表达 FBA，提示 FBA 可能参与了致宿主细胞的损伤。除此之外，猪链球菌醛缩酶也被证明是一个免疫原性膜蛋白[9]。因人和动物没有这类醛缩酶, FBA 已作为新药物靶标用于研发新的抗生素[10]，所以对病原微生物FBA作用机制及糖酵解途径的研究有利于指导临床微生物感染的防治及临床新药物的研发。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 Mhp168L 弱毒株的准备
取对数期的 Mhp168L 弱毒株的培养物，经处理后分小瓶冻干保存，每瓶 1mL。随机取小瓶复苏后测定 CCU，重复三次，取平均值作为复苏后支原体的浓度。每次试验时用 PBS 稀释冻干菌株，12000r/min 离心 30min，取沉淀 PBS 洗涤 1 次， 根据复苏后支原体原始浓度，用 DMEM 维持液重悬，调整菌体滴度至 2.5×107CCU /mL，用于感染试验。
1．1．2 培养基
KM2 培养基： 使用已有江苏省农科院兽医所KM2 培养基；
1640 培养基： 配置5L 1640 培养基于4℃中保存；
1．1．3 ATP
购买商品ATP粉末配置浓度为25%的ATP溶液，4℃保存；实验中终浓度梯度为2%、4%、6%、8%、10%。
1．1．4 葡萄糖
用葡萄糖粉末配置浓度为25%的葡萄糖溶液，4℃保存；实验中终浓度梯度为2%、4%、6%、8%、10%。
1．1．5 猪喉气管上皮细胞
即前期猪喉气管上皮细胞的复苏，培养及传代（详见实验方法）。
1．2 实验方法
1．2．1 细胞的培养及传代
（1）从液氮罐中取出猪喉气管上皮细胞，于60℃温水中水浴约1min；
（2）解冻后的猪喉上皮细胞液用移液器加入细胞瓶内，添加1640培养基，轻轻摇匀，放置于温箱过夜；
（3）第二天早晨，使用显微镜观察，细胞长满80%以上时则可进行传代；
（4）取出胰酶、1640培养基，温箱中进行解冻；并准备三个高压灭菌后的细胞瓶待用；
（5）进入细胞间，穿上消毒防护衣后，用酒精消毒双手，并用酒精棉球擦拭消毒超净台和实验所用材料，点燃酒精灯，将所需实验材料放置于超净台内；
（6）将细胞瓶从温箱中取出，在酒精灯旁拧开瓶口，酒精灯灼烧瓶口，用移液器加入胰酶1ml并润洗10遍；
（7）润洗结束后加2ml胰酶消化，左右晃匀20 次，弃去胰酶，拧上瓶盖放置于温箱进行消化12min；
（8）消化结束后取出取出细胞瓶在酒精灯旁打开，用移液器加入510ml 1640培养基终止消化，吹打清洗细胞瓶底部及瓶壁；（4050次）
（9）用胶头滴管将细胞液分别加入三个新的细胞瓶中，换滴管加1640培养基至约10ml，轻轻摇匀；
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