裂谷热病毒n蛋白的原核表达及多克隆抗体制备(附件)
裂谷热（RVF）是由裂谷热病毒（裂谷热病毒，RVFV）引起的一种急性发热性人兽共患病，由节肢动物传播。该病主要在非洲流行，主要感染反刍动物，可引起流产和新生儿死亡，人类普遍易患此病，严重者可导致死亡。本实验构建了裂谷热病毒N基因原核表达质粒pET-28a-N,转化BL21(DE3)，IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE和Western Blot检测蛋白的表达，同时优化蛋白表达条件以获得最佳表达条件。重组蛋白分子量约为29kD，主要以上清形式存在，优化表达条件为用终浓度0.5mM的IPTG诱导5h。按照优化条件大量表达后采用His纯化柱纯化重组蛋白，用纯化后的重组蛋白免疫山羊、小鼠，定期收集血清制备多克隆抗体。采用间接ELISA检测抗体效价，并用Western Blot检测多抗反应性。结果表明三次免疫后小鼠效价可达12800，山羊二免后即可达12800，Western Blot检测制备的多抗均可与蛋白特异性反应。上述试验结果为RVFV 单克隆抗体的制备和ELISA方法的建立奠定了基础。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法3
1.1材料4
1.1.1质粒和试剂4
1.2研究方法4
1.2.1重组蛋白的表达与鉴定4
1.2.2 N蛋白表达条件的优化5
1.2.2.1不同浓度诱导剂量对N蛋白表达的影响5
1.2.2.2不同诱导时间对N蛋白表达的影响5
1.2.3多克隆抗体的制备5
1.2.3.1免疫BALB/c小鼠5
1.2.3.2山羊免疫与抗体制备6
1.2.3.3抗体效价的测定6
1.2.3.4 Western Blot鉴定抗体的特异性6
2结果与分析5
2.1重组蛋白的诱导表达鉴定及纯化6
2.1.1重组N蛋白表达的测定6
2.1.2 P蛋白表达条件的优化7
2.1.3重组N蛋白的纯化8
2.2多克隆抗体的检测9
2.2.1抗体效价的测定9
2.2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
.2抗体特异性的检测9
3讨论9
致谢10
参考文献11
裂谷热病毒N蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
引言
裂谷热（rift valley fever，RVF）是由裂谷热病毒引起的一种重要的严重影响公共卫生和动物的新兴病毒病，由节肢动物蚊蝇类作为其传播媒介，或通过接触传播等。裂谷热主要传染对象是反刍动物，同时人也是易感对象。动物感染裂谷热后多表现流涕、厌食、高烧不退、急性腹泻甚至黄疸等症状。牛羊的死亡率高，怀孕母牛羊感染后易发生流产[1]。人感染后症状与流行性感冒很类似。
裂谷热病毒主要经蚊叮咬传播给人，故多发生于大雨季节蚊类活动频繁时期，现肯尼亚、马达加斯加、南非、埃及、也门及阿拉伯半岛等地都爆发过大规模疫情。1931年在肯尼亚 ，Daubney等人第一次在羊群中鉴定出。在1977年它突然在埃及引起大爆发之前，除了撒哈拉以南的非洲国家，其他地区从未被报道过，这时动物和人是主要传播感染对象。然而，19771978年间在埃及的爆发则开始主要面对人群。2000年前，此病一直主要在非洲的南部和东部地区流行，但在2000年9月，此病开始在中东地区的阿拉伯半岛和也门爆发，此次爆发在三个月内陆续发现1087个疑似病例，其中有121人死亡［2］，这引起了全球医疗和兽医的关注。此后，非洲东部和南部及阿拉伯半岛地区开始周期性流行［3］。
RVF潜伏期短, 病程发展迅速，犊牛、幼龄山羊和幼龄绵羊是本病的主要传染源。羔羊和犊牛死亡率可达90% ,怀孕母羊和母牛流产率高达80100%[1],人感染后主要由于出血热并发症引起死亡。在患者患畜的血液和咽部，可明显发现病毒存在，因此患者患畜和其他病毒携带者也可成为本病的传染源。其血液、体液、新鲜内脏和各类器官都可能成为裂谷热病毒的扩散者。且绵羊和骆驼这两种动物是该病毒的扩大器，尤其绵羊是RVFV的扩增宿主和二级传染源。它们感染后极易发生高病毒血症，这样会引起该病毒大规模的扩散。
蚊虫将具有感染性的卵产在土壤中，病毒的芽孢在恶劣条件下可在土壤中保持休眠以保护病毒自身，一旦环境适宜或者外界影响其生活史发展的因素消失，如多雨天气的大量的降雨、洪水发生或社会防疫力度下降或防御措施的停止，病毒可灵敏的感受到并可导致随着更多蚊虫产卵孵化，新一代蚊虫滋生，感染性蚊虫翻倍，然后新一轮RVF暴发。RVFV也可以普遍感染人类，在病毒流行区呆过的游人或者牧民等常驻人口、在流行地区从事牲畜屠宰、牲畜治疗的兽医等也极易感染，在流行区藏污纳垢、污水、环境脏乱地区滞留的人更是大大增加了感染风险。这些高危人群都是通过直接接触、处理感染病畜或饲养材料、环境或通过蚊虫媒介叮咬感染的。
如今国际兽疫局(OIE）已将其列为A类疫病.并进行严格监管。裂谷热导致了严重的人畜共患病，引起了严重的公共卫生问题，同时因病死亡牲畜而引起的严重经济效益问题也亟待解决。全球气候变暖，会有利于蚊媒病毒的传播，这引起人们的担心：世界其它地区也将因此受到裂谷热病毒的感染。
RVFV属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）白蛉热病毒属（Phlebovirus），该病毒具有典型的布尼亚病毒的病毒形态和生物学特性。根据该病毒基因组3个节段的比对结果，该病毒被分为3个群，分别为North Africa、West Africa、East/Central Africa[4]。其中最具代表性的病毒株即RVFV基因组，目前仅有一个血清型，其组成为3节段的负链RNA，分别为L、M、S节段。其中目的蛋白所在的M节段长3885nt，共反向编码4个蛋白：糖蛋白Gn和Gc为主要蛋白，剩下的非结构蛋白（NSm，14kDa）和结构蛋白（N，78kDa）[5]为2个次要蛋白。N蛋白在RVFV感染时，表达量大，保守性强，并且作为病毒主要的结构蛋白，在病毒感染初期便能大量表达，极易被检测到，故现作为当前针对RVFV快速诊断的主要抗原蛋白[67]。
本实验将已构建好的质粒转化至在BL21感受态细胞中，通过IPTG诱导表达结构蛋白基因片段，重组蛋白经Ni柱His Band亲和层析纯化后，获得纯化蛋白，为后续快速检测RVF奠定基础。通过免疫小鼠和山羊，获得多克隆抗体。
1.材料与方法：
1.1质粒和试剂
包含RVFV N完整阅读框的重组质粒pET28a（+）NP由江苏农科院兽医研究所动物疫病诊断组实验室保存；限制性内切酶购自大连宝生物工程有限公司；质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自杭州Axygen公司；HRP标记的羊抗小鼠/兔抗山羊IgG、His标签单抗、大肠杆菌BL21感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；HisTrapHP亲和纯化柱购自GE公司；DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；其他常规用试剂为国产或进口分析纯。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言3
1材料与方法3
1.1材料4
1.1.1质粒和试剂4
1.2研究方法4
1.2.1重组蛋白的表达与鉴定4
1.2.2 N蛋白表达条件的优化5
1.2.2.1不同浓度诱导剂量对N蛋白表达的影响5
1.2.2.2不同诱导时间对N蛋白表达的影响5
1.2.3多克隆抗体的制备5
1.2.3.1免疫BALB/c小鼠5
1.2.3.2山羊免疫与抗体制备6
1.2.3.3抗体效价的测定6
1.2.3.4 Western Blot鉴定抗体的特异性6
2结果与分析5
2.1重组蛋白的诱导表达鉴定及纯化6
2.1.1重组N蛋白表达的测定6
2.1.2 P蛋白表达条件的优化7
2.1.3重组N蛋白的纯化8
2.2多克隆抗体的检测9
2.2.1抗体效价的测定9
2.2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
.2抗体特异性的检测9
3讨论9
致谢10
参考文献11
裂谷热病毒N蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
引言
裂谷热（rift valley fever，RVF）是由裂谷热病毒引起的一种重要的严重影响公共卫生和动物的新兴病毒病，由节肢动物蚊蝇类作为其传播媒介，或通过接触传播等。裂谷热主要传染对象是反刍动物，同时人也是易感对象。动物感染裂谷热后多表现流涕、厌食、高烧不退、急性腹泻甚至黄疸等症状。牛羊的死亡率高，怀孕母牛羊感染后易发生流产[1]。人感染后症状与流行性感冒很类似。
裂谷热病毒主要经蚊叮咬传播给人，故多发生于大雨季节蚊类活动频繁时期，现肯尼亚、马达加斯加、南非、埃及、也门及阿拉伯半岛等地都爆发过大规模疫情。1931年在肯尼亚 ，Daubney等人第一次在羊群中鉴定出。在1977年它突然在埃及引起大爆发之前，除了撒哈拉以南的非洲国家，其他地区从未被报道过，这时动物和人是主要传播感染对象。然而，19771978年间在埃及的爆发则开始主要面对人群。2000年前，此病一直主要在非洲的南部和东部地区流行，但在2000年9月，此病开始在中东地区的阿拉伯半岛和也门爆发，此次爆发在三个月内陆续发现1087个疑似病例，其中有121人死亡［2］，这引起了全球医疗和兽医的关注。此后，非洲东部和南部及阿拉伯半岛地区开始周期性流行［3］。
RVF潜伏期短, 病程发展迅速，犊牛、幼龄山羊和幼龄绵羊是本病的主要传染源。羔羊和犊牛死亡率可达90% ,怀孕母羊和母牛流产率高达80100%[1],人感染后主要由于出血热并发症引起死亡。在患者患畜的血液和咽部，可明显发现病毒存在，因此患者患畜和其他病毒携带者也可成为本病的传染源。其血液、体液、新鲜内脏和各类器官都可能成为裂谷热病毒的扩散者。且绵羊和骆驼这两种动物是该病毒的扩大器，尤其绵羊是RVFV的扩增宿主和二级传染源。它们感染后极易发生高病毒血症，这样会引起该病毒大规模的扩散。
蚊虫将具有感染性的卵产在土壤中，病毒的芽孢在恶劣条件下可在土壤中保持休眠以保护病毒自身，一旦环境适宜或者外界影响其生活史发展的因素消失，如多雨天气的大量的降雨、洪水发生或社会防疫力度下降或防御措施的停止，病毒可灵敏的感受到并可导致随着更多蚊虫产卵孵化，新一代蚊虫滋生，感染性蚊虫翻倍，然后新一轮RVF暴发。RVFV也可以普遍感染人类，在病毒流行区呆过的游人或者牧民等常驻人口、在流行地区从事牲畜屠宰、牲畜治疗的兽医等也极易感染，在流行区藏污纳垢、污水、环境脏乱地区滞留的人更是大大增加了感染风险。这些高危人群都是通过直接接触、处理感染病畜或饲养材料、环境或通过蚊虫媒介叮咬感染的。
如今国际兽疫局(OIE）已将其列为A类疫病.并进行严格监管。裂谷热导致了严重的人畜共患病，引起了严重的公共卫生问题，同时因病死亡牲畜而引起的严重经济效益问题也亟待解决。全球气候变暖，会有利于蚊媒病毒的传播，这引起人们的担心：世界其它地区也将因此受到裂谷热病毒的感染。
RVFV属于布尼亚病毒科（Bunyaviridae）白蛉热病毒属（Phlebovirus），该病毒具有典型的布尼亚病毒的病毒形态和生物学特性。根据该病毒基因组3个节段的比对结果，该病毒被分为3个群，分别为North Africa、West Africa、East/Central Africa[4]。其中最具代表性的病毒株即RVFV基因组，目前仅有一个血清型，其组成为3节段的负链RNA，分别为L、M、S节段。其中目的蛋白所在的M节段长3885nt，共反向编码4个蛋白：糖蛋白Gn和Gc为主要蛋白，剩下的非结构蛋白（NSm，14kDa）和结构蛋白（N，78kDa）[5]为2个次要蛋白。N蛋白在RVFV感染时，表达量大，保守性强，并且作为病毒主要的结构蛋白，在病毒感染初期便能大量表达，极易被检测到，故现作为当前针对RVFV快速诊断的主要抗原蛋白[67]。
本实验将已构建好的质粒转化至在BL21感受态细胞中，通过IPTG诱导表达结构蛋白基因片段，重组蛋白经Ni柱His Band亲和层析纯化后，获得纯化蛋白，为后续快速检测RVF奠定基础。通过免疫小鼠和山羊，获得多克隆抗体。
1.材料与方法：
1.1质粒和试剂
包含RVFV N完整阅读框的重组质粒pET28a（+）NP由江苏农科院兽医研究所动物疫病诊断组实验室保存；限制性内切酶购自大连宝生物工程有限公司；质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自杭州Axygen公司；HRP标记的羊抗小鼠/兔抗山羊IgG、His标签单抗、大肠杆菌BL21感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；HisTrapHP亲和纯化柱购自GE公司；DAB显色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；其他常规用试剂为国产或进口分析纯。
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