猪链球菌2型强毒株特有蛋白KAR的原核表达及特性分析
猪链球菌2型强毒株特有蛋白KAR的原核表达及特性分析[20200507184458]
摘要：猪链球菌（Streptococcus suis）属于球菌科、链球菌属,分为33个血清型，其中2型致病力最强，可引起人和猪的感染，甚至死亡。张炜等通过前期对猪链球菌2型强弱毒株的比较蛋白组学研究，发现强毒株特有的蛋白3-ketoacyl-acyl-carrier-protein reductase(KAR），可能与细菌的毒力密切相关。为了验证KAR与毒力的相关性，我们针对kar序列设计引物，通过PCR方法扩增了完整的kar基因，将PCR产物插入pET-32a载体中，构建重组质粒，并转化入感受态细胞DH5α中。从阳性克隆提取重组质粒转化入BL21感受态细胞中。利用诱导剂IPTG进行诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE检测，结果表明KAR蛋白表达成功。通过Western-blot鉴定，发现该蛋白具有较好的免疫原性。为进一步研究KAR蛋白的作用以及SS2毒力因子奠定了基础。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
关键字:猪链球菌2型；KAR蛋白；克隆表达；免疫原性
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1 材料和方法 2
1．1 材料 2
1.1.1 猪链球菌菌株 2
1.1.2 质粒及感受态细胞 2
1.1.3 细菌前期培养各种试剂 2
1.1.4 引物 2
1.1.5 抗体 2
1.1.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂 3
1.1.7 Western-blot试剂 3
1.1.8蛋白质纯化试剂 3
1.1.9 主要仪器 3
1．2 方法 3
1.2.1 ZY05719的kar基因的PCR扩增 3
1.2.2 pET-kar重组表达载体的构建 3
1.2.2.1 PCR产物的小量胶回收试剂盒法回收 3
1.2.2.2 含pET-32a质粒DH5α E.coli的增殖和质粒的提取 4
1.2.2.3 目的片段与质粒载体的双酶切及回收 4
1.2.2.4 目的片段和质粒载体的连接 4
1.2.2.5 连接产物的转化 5
1.2.2.6 PCR鉴定重组质粒 5
1.2.2.7 酶切鉴定阳性重组质粒 5
1.2.2.8 阳性克隆转化 5
1.2.2.9 酶切鉴定阳性重组质粒 6
1.2.3 BL21中kar诱导表达 6
1.2.3.1 含阳性质粒的E.coli的诱导表达样品处理 6
1.2.3.2 样品处理 6
1.2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
.3.3 SDS-PAGE 6
1.2.4 Western-blot 6
2 结果与分析 7
2.1 生物信息学预测结果 7
2.2 KAR基因的PCR结果 7
2.3 pET-kar重组质粒鉴定 8
2.3.1 pET-kar重组质粒的PCR鉴定 8
2.3.2 pET-kar重组质粒的酶切鉴定 8
2.3.3 pET-kar重组质粒的测序鉴定 8
2.4 BL21中KAR蛋白诱导表达 9
2.4.1 诱导表达KAR蛋白 9
2.5 Western Blot 10
2.5.1 检测蛋白的免疫原性 10
2.5.2 检测包涵体中蛋白免疫原性 10
3 讨论 11
3.1 本实验的研究意义 11
致谢 12
参考文献： 12
猪链球菌2型强毒株特有蛋白KAR的原核表达及特性分析
引言
优良（15—11分） 一般（10—6分） 较差（5—0）
二、观察、收集、整理、查阅资料及运用数据的水平
优良（30—21分） 一般（20—11分） 较差（10—0分）
三、学生的独立工作能力和动手能力
优良（20—16分） 一般（15—11分） 较差（10—0分）
四、毕业论文写作的规范化程度
优良（15—11分） 一般（10—6分） 较差（5—0分）
五、毕业论文（设计）总体评价
优良（20—16分） 一般（15—6分） 较差（5—0分）
本科生毕业论文（设计）成绩评阅表
论文题目 猪链球菌2型强毒株特有蛋白KAR的原核表达及特性分析
一、论文选题的价值与合理性
优秀（15—11分） 一般（10—6分） 较差（5—0）
二、论文的难度、工作量大小和创新性
优秀（30—21分） 一般（20—11分） 较差（10—0分）
三、数据资料分析、归纳、概括及运算的能力
优秀（20—16分） 一般（15—11分） 较差（10—0分）
四、文字表达水平、文章的逻辑性
优秀（15—11分） 一般（10—6分） 较差（5—0分）
五、论文写作的规范化程度
优秀（20—16分） 一般（15—6分） 较差（5—0分）
本科生毕业论文（设计）答辩及综合评分表
（由答辩小组填写）
论文题目 猪链球菌2型强毒株特有蛋白KAR的原核表达及特性分析
一、内容的科学性、应用性和创新性
优秀（30—21分） 一般（20—11分） 较差（10—0）
二、论文写作水平及知识面掌握程度
优秀（30—21分） 一般（20—11分） 较差（10—0分）
三、语言表达能力、逻辑思维能力、回答问题的正确性
优秀（40—31分） 一般（30—11分） 较差（10— *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
0分）
论文答辩成绩： 答辩小组负责人（签名）： 年 月 日
本科生毕业论文（设计）综合评定成绩
（由答辩委员会填写）
注：综合评定成绩等级：优秀（90-100），良好（80-89），中等（70-79），及格（60-69），不及格（60分以下）。
答辩委员会负责人（签名）： 年 月 日
摘要：猪链球菌（Streptococcus suis）属于球菌科、链球菌属,分为33个血清型，其中2型致病力最强，可引起人和猪的感染，甚至死亡。张炜等通过前期对猪链球菌2型强弱毒株的比较蛋白组学研究，发现强毒株特有的蛋白3-ketoacyl-acyl-carrier-protein reductase(KAR），可能与细菌的毒力密切相关。为了验证KAR与毒力的相关性，我们针对kar序列设计引物，通过PCR方法扩增了完整的kar基因，将PCR产物插入pET-32a载体中，构建重组质粒，并转化入感受态细胞DH5α中。从阳性克隆提取重组质粒转化入BL21感受态细胞中。利用诱导剂IPTG进行诱导表达，对表达产物进行SDS-PAGE检测，结果表明KAR蛋白表达成功。通过Western-blot鉴定，发现该蛋白具有较好的免疫原性。为进一步研究KAR蛋白的作用以及SS2毒力因子奠定了基础。
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关键字:猪链球菌2型；KAR蛋白；克隆表达；免疫原性
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摘要 1
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Abstract 1
Key words 1
1 材料和方法 2
1．1 材料 2
1.1.1 猪链球菌菌株 2
1.1.2 质粒及感受态细胞 2
1.1.3 细菌前期培养各种试剂 2
1.1.4 引物 2
1.1.5 抗体 2
1.1.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂 3
1.1.7 Western-blot试剂 3
1.1.8蛋白质纯化试剂 3
1.1.9 主要仪器 3
1．2 方法 3
1.2.1 ZY05719的kar基因的PCR扩增 3
1.2.2 pET-kar重组表达载体的构建 3
1.2.2.1 PCR产物的小量胶回收试剂盒法回收 3
1.2.2.2 含pET-32a质粒DH5α E.coli的增殖和质粒的提取 4
1.2.2.3 目的片段与质粒载体的双酶切及回收 4
1.2.2.4 目的片段和质粒载体的连接 4
1.2.2.5 连接产物的转化 5
1.2.2.6 PCR鉴定重组质粒 5
1.2.2.7 酶切鉴定阳性重组质粒 5
1.2.2.8 阳性克隆转化 5
1.2.2.9 酶切鉴定阳性重组质粒 6
1.2.3 BL21中kar诱导表达 6
1.2.3.1 含阳性质粒的E.coli的诱导表达样品处理 6
1.2.3.2 样品处理 6
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.3.3 SDS-PAGE 6
1.2.4 Western-blot 6
2 结果与分析 7
2.1 生物信息学预测结果 7
2.2 KAR基因的PCR结果 7
2.3 pET-kar重组质粒鉴定 8
2.3.1 pET-kar重组质粒的PCR鉴定 8
2.3.2 pET-kar重组质粒的酶切鉴定 8
2.3.3 pET-kar重组质粒的测序鉴定 8
2.4 BL21中KAR蛋白诱导表达 9
2.4.1 诱导表达KAR蛋白 9
2.5 Western Blot 10
2.5.1 检测蛋白的免疫原性 10
2.5.2 检测包涵体中蛋白免疫原性 10
3 讨论 11
3.1 本实验的研究意义 11
致谢 12
参考文献： 12
猪链球菌2型强毒株特有蛋白KAR的原核表达及特性分析
引言
优良（15—11分） 一般（10—6分） 较差（5—0）
二、观察、收集、整理、查阅资料及运用数据的水平
优良（30—21分） 一般（20—11分） 较差（10—0分）
三、学生的独立工作能力和动手能力
优良（20—16分） 一般（15—11分） 较差（10—0分）
四、毕业论文写作的规范化程度
优良（15—11分） 一般（10—6分） 较差（5—0分）
五、毕业论文（设计）总体评价
优良（20—16分） 一般（15—6分） 较差（5—0分）
本科生毕业论文（设计）成绩评阅表
论文题目 猪链球菌2型强毒株特有蛋白KAR的原核表达及特性分析
一、论文选题的价值与合理性
优秀（15—11分） 一般（10—6分） 较差（5—0）
二、论文的难度、工作量大小和创新性
优秀（30—21分） 一般（20—11分） 较差（10—0分）
三、数据资料分析、归纳、概括及运算的能力
优秀（20—16分） 一般（15—11分） 较差（10—0分）
四、文字表达水平、文章的逻辑性
优秀（15—11分） 一般（10—6分） 较差（5—0分）
五、论文写作的规范化程度
优秀（20—16分） 一般（15—6分） 较差（5—0分）
本科生毕业论文（设计）答辩及综合评分表
（由答辩小组填写）
论文题目 猪链球菌2型强毒株特有蛋白KAR的原核表达及特性分析
一、内容的科学性、应用性和创新性
优秀（30—21分） 一般（20—11分） 较差（10—0）
二、论文写作水平及知识面掌握程度
优秀（30—21分） 一般（20—11分） 较差（10—0分）
三、语言表达能力、逻辑思维能力、回答问题的正确性
优秀（40—31分） 一般（30—11分） 较差（10— *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
0分）
论文答辩成绩： 答辩小组负责人（签名）： 年 月 日
本科生毕业论文（设计）综合评定成绩
（由答辩委员会填写）
注：综合评定成绩等级：优秀（90-100），良好（80-89），中等（70-79），及格（60-69），不及格（60分以下）。
答辩委员会负责人（签名）： 年 月 日
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