发酵床养鸭场垫料源大肠杆菌抗生素耐药性演变规律的研究
发酵床养鸭场垫料源大肠杆菌抗生素耐药性演变规律的研究[20200510204825]
摘要：长期不科学的用药方法，导致畜牧业中致病性大肠杆菌对许多重要抗生素的耐药性快速提升并广泛传播。目前国内对猪源致病性大肠杆菌耐药性研究较多，而对肉鸭养殖业特别是发酵床床体中致病性大肠杆菌耐药性研究较少。本实验将对肉鸭发酵床养殖场垫料源致病性大肠杆菌的耐药性演变规律进行研究。实验结果显示：第8批次发酵床垫料分离得到的大肠杆菌对头孢噻呋、氟苯尼考、氧氟沙星、恩诺沙星耐药率分别达到69.6%、100.0%、91.3%、85.5%，相对于第4批次有显著提高，建议更换垫料和预防药物的配方。
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关键字:养鸭场发酵床垫料；大肠杆菌；抗生素耐药性；演变规律
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1 采样2
1.2 细菌计数2
1.3大肠杆菌的分离与鉴定2
1.4抗生素敏感性检测3
1.5统计方法3
2 结果分析3
3 讨论5
4 结论6
致谢.6
参考文献6
养鸭场发酵床垫料源大肠杆菌抗生素耐药性演变规律的研究
引言
引言 大肠杆菌是动物肠道内主要菌群之一，分为致病性与非致病性，动物排泄物是其散播于周围环境中的主要途径。抗生素的合理与有效使用，是控制与预防大肠杆菌病的重要措施。但多年来，长期饲喂含亚治疗剂量抗生素的饲料、频繁的用药等不科学的用药方法，导致畜牧业中致病性大肠杆菌对许多重要抗生素的耐药性快速提升并广泛传播[1]。大肠杆菌耐药谱不断扩大和耐药水平不断提高，大肠杆菌耐药及多重耐药现象已十分严重。耐药性产生的直接后果是严重影响临床疗效，增加治疗成本，同时缩短新药的应用周期，增大新药的研究与开发成本。
大肠杆菌的耐药性可以天然固有，也可以通过后天的基因突变、基因转移获得。固有耐药性与细菌的遗传和进化密切相关，它的产生并不由抗菌药物是否存在细菌周围环境决定[2]。在抗菌药物环境的选择性压力下，细菌也可以经过基因突变，或在生长过程中由于移动耐药因子的转移而产生了获得耐药性[3]。细菌的耐药性基因可通过3种方式表达：（1）表达酶对抗菌药物的修饰和破坏是大肠杆菌常见的耐药机理之一，包括氨基糖苷类钝化酶、β－内酰胺酶、乙酰转移酶(耐氯霉素)和酯酶(耐大环内酯类)。所有的β－内酰胺酶都可打开在常见 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
的青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和单环类中的β－内酰胺酶。[4](2)通过主动外作用可将药物从菌体内排出，使细菌产生对多种抗生素的耐药性。(3)大肠杆菌外膜上存在的多种外膜蛋白质,却对大多数疏水性药物具有良好的通透性。OmpF蛋白缺失的大肠杆菌可提供对四环素、氯霉素、诺氟沙星低水平的耐药[5],OmpF或OmpC蛋白缺失的大肠杆菌可提供对β－内酰胺酶类抗生素低水平的耐药[6]耐药性产生的直接后果是严重影响临床疗效，增加治疗成本，同时缩短新药的应用周期，增大新药的研究与开发成本。大肠杆菌作为耐药性检测的指示菌株，本实验将对肉鸭发酵床养殖场垫料源致病性大肠杆菌的耐药性演变规律进行研究，为探索并解决养鸭业细菌耐药性迅速恶化提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 采样
选取中国江苏某肉鸭发酵床养殖场进行不同饲养批次肉鸭发酵床垫料采样。选取3栋鸭舍（长：9.5m，宽：53m），于饲养4批次肉鸭、8批次肉鸭时，共计6栋进行垫料采样。进入不同鸭舍时，试验人员均需更换无菌手套与鞋套，并佩戴医用口罩，取样时选取鸭舍中部相邻5点(每点相聚6 m)，将各点垫料充分混匀后分别装入各个无菌冻存管，立即放入冷藏盒内，并于1小时内带入实验室立即进行细菌计数试验。作为对照，选取3栋未饲养肉鸭与未接种菌剂的垫料，采用相同方法取样并进行保存。
发酵床主要由木屑、稻壳、少量麸皮按特定比例混合制作而成，厚约40cm，初次使用时接种有芽孢杆菌与放线菌等菌剂，每栋肉鸭舍垫料均采用相同原料与比例、同批次制作而成。每批次肉鸭(樱桃谷肉鸭) 1～15日龄于育雏舍进行育雏，15日龄运至各发酵床鸭舍进行饲养，每栋饲养1200～1800羽，饲养密度为2.4～3.6羽/平米，待饲养至34日龄（进入鸭舍第20天）时进行垫料采样。发酵床饲养1～8批次肉鸭期间，未补充木屑等新鲜原料，每两天需充分翻耙垫料一次，饲养期间雇佣统一饲养员。
1.2 细菌计数
准确称取每栋鸭舍各采样点样品2g，将10g垫料样/栋放入含90ml无菌PBS的锥形瓶中(含玻璃珠)，涡旋3min制成垫料悬液并进行10倍系列稀释，选择3个适宜稀释度的样品匀液，各取200ml分别加入麦康凯琼脂培养基(MacConkey agar)，以及含16ug/ml强力霉素或者8ug/ml氧氟沙星的麦康凯琼脂培养基，每个稀释度做三个平行培养皿。每种平板倒置于37℃恒温培养箱，培养24h后对各种培养基分别计数。加入培养基的抗生素均按照药物本身的效价进行计算与称重。耐受某浓度抗生素菌落数比例=该浓度抗生素平板菌落计数/对应未加抗生素平板菌落计数。
1.3大肠杆菌的分离与鉴定
每栋鸭舍选取分布均匀、疑似大肠杆菌菌落较多的麦康凯琼脂培养基，每种类型培养基平板挑取不少于5株疑似大肠杆菌菌落，划线于伊红美蓝色琼脂培养基，并将平板倒置培养于37℃恒温培养箱培养16～24h。选取生长良好的带金属光泽的单菌落接种于5mL营养肉汤液体培养基中，37°C摇床培养16～20h。将增殖后的菌液分装于2mL灭菌冻存管内，并按照1 : 1的体积比加入40%灭菌甘油，置于-20℃冰箱保存。
初步鉴定大肠杆菌采用革兰氏阴性菌染色鉴定。先在载玻片上滴加一滴生理盐水，选取纯化后的单菌落均匀涂于载玻片上，风干后在酒精灯火焰上过火，将细菌固定于载玻片表面。滴加草酸 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
氨结晶紫，染色约l～2min，流水冲洗。用碘液去除残留的水，并滴上碘液覆盖约1min，流水冲洗。待载玻片干燥后，用95%酒精冲洗，当冲洗的酒精不再变色则停止，立即用水冲净酒精。用番红染液染色约2～3min，流水冲洗。待玻片干燥后，在油镜下观察。大肠杆菌为革兰氏阴性菌。染色后，革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
将符合大肠杆菌形态特征并且革兰氏染色为阴性的细菌接种于灭菌营养肉汤中，37°C恒温箱培养16～24h。吸取适量菌液涂于氧化酶试纸一端，10～20S内观察试验结果。试纸变为紫红色为阳性，无色或淡黄色则为阴性。选取氧化酶试验阴性的菌株进行下一步的生化鉴定。根据大肠杆菌生化鉴定特征，选取三糖铁以及肠杆菌科细菌生化编码鉴定管进行鉴定，部分方法如李玲所述[7]。
1.4抗生素敏感性检测
参照临床与实验标准协会(CLSI， 2012)所提供的方法与标准，采用MH微量肉汤稀释法对本试验分离大肠杆菌（n=152）进行6种抗生素敏感性检测。本试验受试菌为鸭源大肠杆菌，仍参照CLSI标准中人类、以及其它种类动物源大肠杆菌的判定标准，对各类抗生素敏感性判定标准如下：氨苄西林(32mg/ml)、头孢噻呋(8mg/ml)、庆大霉素(16mg/ml)、氟苯尼考(8mg/ml)、恩诺沙星(2mg/ml)、四环素(16mg/ml)。质控菌为大肠杆菌ATCC 25922。
参照Knezevic and Petrovic (2008) [8]对各组分离的大肠杆菌进行单种药物耐受水平评定：极高（>75%菌株数）、高（50–75%菌株数）、中度(30–50%菌株数)、低(10–30%菌株数)、极低(0–10%菌株数)。将所有受试大肠杆菌对各类抗生素敏感试验结果判为耐受，非耐受（敏感或者中介类型），其中耐受3种或更多不同类型中抗生素的菌株即为多耐型菌株。
1.5统计方法
采用GLM单因素方差分析进行各组间肉鸭发酵床垫料不同琼脂培养基细菌计数差异显著性。使用基于秩的方差分析比较各组间肉鸭发酵床垫料耐药细菌数比例差异显著性。采用Fisher精确检验进行不同饲养批次间分离得大肠杆菌各类抗生素耐药率与多重耐药率的比较。使用bonferroni法对检验水准进行校正a’=0.025，对任意两组进行Fisher精确检验。
摘要：长期不科学的用药方法，导致畜牧业中致病性大肠杆菌对许多重要抗生素的耐药性快速提升并广泛传播。目前国内对猪源致病性大肠杆菌耐药性研究较多，而对肉鸭养殖业特别是发酵床床体中致病性大肠杆菌耐药性研究较少。本实验将对肉鸭发酵床养殖场垫料源致病性大肠杆菌的耐药性演变规律进行研究。实验结果显示：第8批次发酵床垫料分离得到的大肠杆菌对头孢噻呋、氟苯尼考、氧氟沙星、恩诺沙星耐药率分别达到69.6%、100.0%、91.3%、85.5%，相对于第4批次有显著提高，建议更换垫料和预防药物的配方。
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关键字:养鸭场发酵床垫料；大肠杆菌；抗生素耐药性；演变规律
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1 采样2
1.2 细菌计数2
1.3大肠杆菌的分离与鉴定2
1.4抗生素敏感性检测3
1.5统计方法3
2 结果分析3
3 讨论5
4 结论6
致谢.6
参考文献6
养鸭场发酵床垫料源大肠杆菌抗生素耐药性演变规律的研究
引言
引言 大肠杆菌是动物肠道内主要菌群之一，分为致病性与非致病性，动物排泄物是其散播于周围环境中的主要途径。抗生素的合理与有效使用，是控制与预防大肠杆菌病的重要措施。但多年来，长期饲喂含亚治疗剂量抗生素的饲料、频繁的用药等不科学的用药方法，导致畜牧业中致病性大肠杆菌对许多重要抗生素的耐药性快速提升并广泛传播[1]。大肠杆菌耐药谱不断扩大和耐药水平不断提高，大肠杆菌耐药及多重耐药现象已十分严重。耐药性产生的直接后果是严重影响临床疗效，增加治疗成本，同时缩短新药的应用周期，增大新药的研究与开发成本。
大肠杆菌的耐药性可以天然固有，也可以通过后天的基因突变、基因转移获得。固有耐药性与细菌的遗传和进化密切相关，它的产生并不由抗菌药物是否存在细菌周围环境决定[2]。在抗菌药物环境的选择性压力下，细菌也可以经过基因突变，或在生长过程中由于移动耐药因子的转移而产生了获得耐药性[3]。细菌的耐药性基因可通过3种方式表达：（1）表达酶对抗菌药物的修饰和破坏是大肠杆菌常见的耐药机理之一，包括氨基糖苷类钝化酶、β－内酰胺酶、乙酰转移酶(耐氯霉素)和酯酶(耐大环内酯类)。所有的β－内酰胺酶都可打开在常见 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
的青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和单环类中的β－内酰胺酶。[4](2)通过主动外作用可将药物从菌体内排出，使细菌产生对多种抗生素的耐药性。(3)大肠杆菌外膜上存在的多种外膜蛋白质,却对大多数疏水性药物具有良好的通透性。OmpF蛋白缺失的大肠杆菌可提供对四环素、氯霉素、诺氟沙星低水平的耐药[5],OmpF或OmpC蛋白缺失的大肠杆菌可提供对β－内酰胺酶类抗生素低水平的耐药[6]耐药性产生的直接后果是严重影响临床疗效，增加治疗成本，同时缩短新药的应用周期，增大新药的研究与开发成本。大肠杆菌作为耐药性检测的指示菌株，本实验将对肉鸭发酵床养殖场垫料源致病性大肠杆菌的耐药性演变规律进行研究，为探索并解决养鸭业细菌耐药性迅速恶化提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 采样
选取中国江苏某肉鸭发酵床养殖场进行不同饲养批次肉鸭发酵床垫料采样。选取3栋鸭舍（长：9.5m，宽：53m），于饲养4批次肉鸭、8批次肉鸭时，共计6栋进行垫料采样。进入不同鸭舍时，试验人员均需更换无菌手套与鞋套，并佩戴医用口罩，取样时选取鸭舍中部相邻5点(每点相聚6 m)，将各点垫料充分混匀后分别装入各个无菌冻存管，立即放入冷藏盒内，并于1小时内带入实验室立即进行细菌计数试验。作为对照，选取3栋未饲养肉鸭与未接种菌剂的垫料，采用相同方法取样并进行保存。
发酵床主要由木屑、稻壳、少量麸皮按特定比例混合制作而成，厚约40cm，初次使用时接种有芽孢杆菌与放线菌等菌剂，每栋肉鸭舍垫料均采用相同原料与比例、同批次制作而成。每批次肉鸭(樱桃谷肉鸭) 1～15日龄于育雏舍进行育雏，15日龄运至各发酵床鸭舍进行饲养，每栋饲养1200～1800羽，饲养密度为2.4～3.6羽/平米，待饲养至34日龄（进入鸭舍第20天）时进行垫料采样。发酵床饲养1～8批次肉鸭期间，未补充木屑等新鲜原料，每两天需充分翻耙垫料一次，饲养期间雇佣统一饲养员。
1.2 细菌计数
准确称取每栋鸭舍各采样点样品2g，将10g垫料样/栋放入含90ml无菌PBS的锥形瓶中(含玻璃珠)，涡旋3min制成垫料悬液并进行10倍系列稀释，选择3个适宜稀释度的样品匀液，各取200ml分别加入麦康凯琼脂培养基(MacConkey agar)，以及含16ug/ml强力霉素或者8ug/ml氧氟沙星的麦康凯琼脂培养基，每个稀释度做三个平行培养皿。每种平板倒置于37℃恒温培养箱，培养24h后对各种培养基分别计数。加入培养基的抗生素均按照药物本身的效价进行计算与称重。耐受某浓度抗生素菌落数比例=该浓度抗生素平板菌落计数/对应未加抗生素平板菌落计数。
1.3大肠杆菌的分离与鉴定
每栋鸭舍选取分布均匀、疑似大肠杆菌菌落较多的麦康凯琼脂培养基，每种类型培养基平板挑取不少于5株疑似大肠杆菌菌落，划线于伊红美蓝色琼脂培养基，并将平板倒置培养于37℃恒温培养箱培养16～24h。选取生长良好的带金属光泽的单菌落接种于5mL营养肉汤液体培养基中，37°C摇床培养16～20h。将增殖后的菌液分装于2mL灭菌冻存管内，并按照1 : 1的体积比加入40%灭菌甘油，置于-20℃冰箱保存。
初步鉴定大肠杆菌采用革兰氏阴性菌染色鉴定。先在载玻片上滴加一滴生理盐水，选取纯化后的单菌落均匀涂于载玻片上，风干后在酒精灯火焰上过火，将细菌固定于载玻片表面。滴加草酸 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
氨结晶紫，染色约l～2min，流水冲洗。用碘液去除残留的水，并滴上碘液覆盖约1min，流水冲洗。待载玻片干燥后，用95%酒精冲洗，当冲洗的酒精不再变色则停止，立即用水冲净酒精。用番红染液染色约2～3min，流水冲洗。待玻片干燥后，在油镜下观察。大肠杆菌为革兰氏阴性菌。染色后，革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。
将符合大肠杆菌形态特征并且革兰氏染色为阴性的细菌接种于灭菌营养肉汤中，37°C恒温箱培养16～24h。吸取适量菌液涂于氧化酶试纸一端，10～20S内观察试验结果。试纸变为紫红色为阳性，无色或淡黄色则为阴性。选取氧化酶试验阴性的菌株进行下一步的生化鉴定。根据大肠杆菌生化鉴定特征，选取三糖铁以及肠杆菌科细菌生化编码鉴定管进行鉴定，部分方法如李玲所述[7]。
1.4抗生素敏感性检测
参照临床与实验标准协会(CLSI， 2012)所提供的方法与标准，采用MH微量肉汤稀释法对本试验分离大肠杆菌（n=152）进行6种抗生素敏感性检测。本试验受试菌为鸭源大肠杆菌，仍参照CLSI标准中人类、以及其它种类动物源大肠杆菌的判定标准，对各类抗生素敏感性判定标准如下：氨苄西林(32mg/ml)、头孢噻呋(8mg/ml)、庆大霉素(16mg/ml)、氟苯尼考(8mg/ml)、恩诺沙星(2mg/ml)、四环素(16mg/ml)。质控菌为大肠杆菌ATCC 25922。
参照Knezevic and Petrovic (2008) [8]对各组分离的大肠杆菌进行单种药物耐受水平评定：极高（>75%菌株数）、高（50–75%菌株数）、中度(30–50%菌株数)、低(10–30%菌株数)、极低(0–10%菌株数)。将所有受试大肠杆菌对各类抗生素敏感试验结果判为耐受，非耐受（敏感或者中介类型），其中耐受3种或更多不同类型中抗生素的菌株即为多耐型菌株。
1.5统计方法
采用GLM单因素方差分析进行各组间肉鸭发酵床垫料不同琼脂培养基细菌计数差异显著性。使用基于秩的方差分析比较各组间肉鸭发酵床垫料耐药细菌数比例差异显著性。采用Fisher精确检验进行不同饲养批次间分离得大肠杆菌各类抗生素耐药率与多重耐药率的比较。使用bonferroni法对检验水准进行校正a’=0.025，对任意两组进行Fisher精确检验。
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