和缓艾美耳球虫三种重组蛋白的免疫保护性研究
为预防鸡感染和缓艾美耳球虫（Eimeria mitis）而造成养禽业的经济损失，实验选取和缓艾美耳球虫的重组肌动蛋白解聚因子（ADF）、重组1A蛋白和重组过氧化物酶（Prx）三种重组蛋白对2周龄雏公鸡进行二次免疫，然后用1.2 × 105和缓艾美耳球虫孢子化卵囊对每羽鸡进行攻虫，检测鸡的平均体重增长、攻虫前后血清中的IgA、IgG、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、TGF-β、IFN-γ细胞因子的变化以及攻虫后第5~7天粪便中排出的卵囊减少率，结果显示三种重组蛋白对和缓艾美耳球虫都具有免疫原性，均能诱导鸡产生细胞免疫和体液免疫反应。从体重变化和卵囊减少率来看，重组ADF蛋白的免疫保护效果要高于另两种蛋白。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1实验动物2
1.1.2虫株、菌种、载体和主要试剂2
1.1.3本实验所需试剂的制备2
1.1.4仪器设备3
1.2蛋白的表达和纯化 3
1.3蛋白的免疫保护性实验4
1.3.1实验动物及分组4
1.3.2实验过程4
1.3.3免疫效果评价方式4
1.3.4血清中抗体和细胞因子水平的检测4
1.3.4.1血清的制备4
1.3.4.2酶联免疫吸附实验检测血清抗体水平4
1.3.4.3血清中细胞因子的检测4
1.3.5数据分析4
2结果与分析4
2.1三种重组蛋白抗E. mitis的保护性5
2.2实验动物免疫蛋白后的细胞因子变化5
2.2.1免疫重组Prx蛋白后的变化5
2.2.2免疫重组ADF蛋白后的变化7
2.2.3免疫重组1A蛋白后的变化9
2.2.4不同蛋白组鸡血清中细胞因子浓度变化11
3讨论13
致谢14
参考文献14
图1 免疫重组Prx蛋白的鸡体内细胞因子水平6
图 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
2 免疫重组ADF蛋白的鸡体内细胞因子水平8
图3 免疫重组1A蛋白的鸡体内细胞因子水平10
图4不同蛋白组不同时期内鸡体内细胞因子变化12
和缓艾美耳球虫三种重组蛋白的免疫保护性研究
引言
和缓艾美耳球虫（Eimeria mitis）是鸡常见球虫病中致病性相对较弱的一种[1]，但其对养禽业所造成的经济损失却不容疏忽。据报道，每年有20亿元损失是因为鸡球虫病所导致的[2]，而这其中，和缓艾美耳球虫与其他球虫混合感染导致的球虫致病性的加剧问题早已有报道[3]。小剂量的和缓艾美耳球虫感染一般不会出现可见的病变，这也有可能是与他球虫病症状掩盖了和缓艾美耳球虫的自身症状有关，当鸡受到大剂量的和缓艾美耳球虫卵囊感染后，就会出现腹泻、采食量下降等症状，且因为和缓艾美耳球虫对饲料转化率有影响，会使鸡的体重增长变得缓慢，除此之外，鸡在感染了球虫后会出现带虫现象 [47]，在现代化的大规模饲养环境下这会间接导致鸡球虫病的爆发，对于供不应求的蛋鸡或肉鸡市场来说是个严重问题。
现今, 对于球虫病的防控依然以药物为主但人们对于抗球虫药的滥用造成的药物残留和耐药菌问题已经开始担忧，有研究证明和缓艾美耳球虫能激发宿主产生细胞免疫和体液免疫[8]，于是，近年来球虫疫苗的研发开始转向了基因工程层面[910]。通过研究顶复门寄生虫的表面抗原及各种微线体、折线体等亚细胞器抗原，从球虫入侵相关蛋白方面着手从而进行疫苗的开发[1112]。经由免疫重组疫苗刺激机体发生的免疫比抗球虫药来得健康。本次实验用肌动蛋白解聚因子（actin depolymerizing factor，ADF）蛋白、1A蛋白以及过氧化物酶（Peroxiredoxin，PRX）进行了免疫保护性试验，以探究三种蛋白用作为新型疫苗分子的可能性，为和缓艾美耳球虫的防治提供参考。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验动物
本实验所用鸡购买于南京某养殖场，均为2周龄雏公鸡，饲养环境优良，确保没有细菌、球虫的感染；喂食和饮水时间固定；饲料中没有添加任意一种抗虫药。
1．1．2 虫株、菌种、载体和主要试剂
本实验所用E. mitis由大学兽医寄生虫病学实验室提供，是用和缓艾美球虫孢子化卵囊(1.0 ×105 /羽)接种50只雏鸡， 收集第57d的粪便中的球虫卵囊,并把卵囊孢子化备用。
表达宿主菌BL21（DE3）、表达载体质粒pET32a(+)由大学兽医寄生虫研究室保存。蛋白纯化试剂盒为GE公司的产品。LA Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶BamHⅠ、限制性内切酶HindⅢ、DL2000 DNA Marker和DL5000 DNA Marker等购自宝生物工程（大连）有限公司。
1．1．3 本实验所需试剂的制备
氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)：在超净台中操作，把 2.5g Amp加到50 mL离心管中，添加20 mL灭菌蒸馏水，确保溶解，震荡均匀，定容至25 mL，用 0.22 μm滤膜过滤，然后用2mL的EP管分装，放入透明分装袋中，用标签纸写上试剂的名称和日期，放入20 ℃冰箱冻存备用。
LuriaBertani液体培养基：5g 酵母粉，10g NaCl ，10g 胰蛋白胨，加入到去离子中水，水量约800mL，充分搅拌溶解，定容至1L，根据需要分装到不同规格的容器中，常规高压灭菌后，4 ℃保存备用。
LuriaBertani固体培养基：琼脂糖按 1.5 g/100mL加入LB液体培养基中，装入锥形瓶，高压灭菌，摇晃瓶体使琼脂充分混匀，等温度降低到手背可以触碰瓶身时，在超净台中往里添加氨苄青霉素，摇动混匀，倒入平板。等待一段时间，凝固后把平板盖好，用封口膜封好，4℃冰箱保存备用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1实验动物2
1.1.2虫株、菌种、载体和主要试剂2
1.1.3本实验所需试剂的制备2
1.1.4仪器设备3
1.2蛋白的表达和纯化 3
1.3蛋白的免疫保护性实验4
1.3.1实验动物及分组4
1.3.2实验过程4
1.3.3免疫效果评价方式4
1.3.4血清中抗体和细胞因子水平的检测4
1.3.4.1血清的制备4
1.3.4.2酶联免疫吸附实验检测血清抗体水平4
1.3.4.3血清中细胞因子的检测4
1.3.5数据分析4
2结果与分析4
2.1三种重组蛋白抗E. mitis的保护性5
2.2实验动物免疫蛋白后的细胞因子变化5
2.2.1免疫重组Prx蛋白后的变化5
2.2.2免疫重组ADF蛋白后的变化7
2.2.3免疫重组1A蛋白后的变化9
2.2.4不同蛋白组鸡血清中细胞因子浓度变化11
3讨论13
致谢14
参考文献14
图1 免疫重组Prx蛋白的鸡体内细胞因子水平6
图 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
2 免疫重组ADF蛋白的鸡体内细胞因子水平8
图3 免疫重组1A蛋白的鸡体内细胞因子水平10
图4不同蛋白组不同时期内鸡体内细胞因子变化12
和缓艾美耳球虫三种重组蛋白的免疫保护性研究
引言
和缓艾美耳球虫（Eimeria mitis）是鸡常见球虫病中致病性相对较弱的一种[1]，但其对养禽业所造成的经济损失却不容疏忽。据报道，每年有20亿元损失是因为鸡球虫病所导致的[2]，而这其中，和缓艾美耳球虫与其他球虫混合感染导致的球虫致病性的加剧问题早已有报道[3]。小剂量的和缓艾美耳球虫感染一般不会出现可见的病变，这也有可能是与他球虫病症状掩盖了和缓艾美耳球虫的自身症状有关，当鸡受到大剂量的和缓艾美耳球虫卵囊感染后，就会出现腹泻、采食量下降等症状，且因为和缓艾美耳球虫对饲料转化率有影响，会使鸡的体重增长变得缓慢，除此之外，鸡在感染了球虫后会出现带虫现象 [47]，在现代化的大规模饲养环境下这会间接导致鸡球虫病的爆发，对于供不应求的蛋鸡或肉鸡市场来说是个严重问题。
现今, 对于球虫病的防控依然以药物为主但人们对于抗球虫药的滥用造成的药物残留和耐药菌问题已经开始担忧，有研究证明和缓艾美耳球虫能激发宿主产生细胞免疫和体液免疫[8]，于是，近年来球虫疫苗的研发开始转向了基因工程层面[910]。通过研究顶复门寄生虫的表面抗原及各种微线体、折线体等亚细胞器抗原，从球虫入侵相关蛋白方面着手从而进行疫苗的开发[1112]。经由免疫重组疫苗刺激机体发生的免疫比抗球虫药来得健康。本次实验用肌动蛋白解聚因子（actin depolymerizing factor，ADF）蛋白、1A蛋白以及过氧化物酶（Peroxiredoxin，PRX）进行了免疫保护性试验，以探究三种蛋白用作为新型疫苗分子的可能性，为和缓艾美耳球虫的防治提供参考。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 实验动物
本实验所用鸡购买于南京某养殖场，均为2周龄雏公鸡，饲养环境优良，确保没有细菌、球虫的感染；喂食和饮水时间固定；饲料中没有添加任意一种抗虫药。
1．1．2 虫株、菌种、载体和主要试剂
本实验所用E. mitis由大学兽医寄生虫病学实验室提供，是用和缓艾美球虫孢子化卵囊(1.0 ×105 /羽)接种50只雏鸡， 收集第57d的粪便中的球虫卵囊,并把卵囊孢子化备用。
表达宿主菌BL21（DE3）、表达载体质粒pET32a(+)由大学兽医寄生虫研究室保存。蛋白纯化试剂盒为GE公司的产品。LA Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶BamHⅠ、限制性内切酶HindⅢ、DL2000 DNA Marker和DL5000 DNA Marker等购自宝生物工程（大连）有限公司。
1．1．3 本实验所需试剂的制备
氨苄青霉素(Ampicillin，Amp)：在超净台中操作，把 2.5g Amp加到50 mL离心管中，添加20 mL灭菌蒸馏水，确保溶解，震荡均匀，定容至25 mL，用 0.22 μm滤膜过滤，然后用2mL的EP管分装，放入透明分装袋中，用标签纸写上试剂的名称和日期，放入20 ℃冰箱冻存备用。
LuriaBertani液体培养基：5g 酵母粉，10g NaCl ，10g 胰蛋白胨，加入到去离子中水，水量约800mL，充分搅拌溶解，定容至1L，根据需要分装到不同规格的容器中，常规高压灭菌后，4 ℃保存备用。
LuriaBertani固体培养基：琼脂糖按 1.5 g/100mL加入LB液体培养基中，装入锥形瓶，高压灭菌，摇晃瓶体使琼脂充分混匀，等温度降低到手背可以触碰瓶身时，在超净台中往里添加氨苄青霉素，摇动混匀，倒入平板。等待一段时间，凝固后把平板盖好，用封口膜封好，4℃冰箱保存备用。
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