不同佐剂对TMUV灭活疫苗免疫效果的比较
不同佐剂对TMUV灭活疫苗免疫效果的比较[20200507185911]
摘要：制备不同佐剂的坦布苏毒灭活疫苗，随机选取实验鸡40只，均分成白油组，白油+IL-2组，铝胶组，铝胶+IL-2组，蜂胶组，蜂胶+IL-2组，IL-2组和对照组8个实验组，免疫前，免疫后1周、2周、3周和4周分别采血，用ELISA检测血清中的抗体水平，比较灭活疫苗的免疫效果。结果表明IL-2作为佐剂的灭活疫苗效果最好，优于白油组，白油+IL-2组，铝胶+IL-2组，蜂胶组和蜂胶+IL-2组，铝胶组效果最差。
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关键字:佐剂；坦布苏病毒；灭活疫苗；免疫效果
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言（或绪论）2
1 材料与方法2
1.1 材料 3
1.1.1 病毒株与实验动物3
1.1.2 主要试剂4
1.1.3 主要仪器4
1.2 方法 4
1.2.1 不同佐剂的灭活疫苗的制备4
1.2.1.1 白油佐剂的灭活疫苗的制备4
1.2.1.2 白油+IL-2佐剂的灭活疫苗的制备4
1.2.1.3 铝胶佐剂的灭活疫苗的制备4
1.2.1.4 铝胶+IL-2佐剂的灭活疫苗的制备4
1.2.1.5 蜂胶佐剂的灭活疫苗的制备4
1.2.1.6 蜂胶+IL-2佐剂的灭活疫苗的制备4
1.2.1.7 IL-2佐剂的灭活疫苗的制备4
1.2.2灭活疫苗的接种4
1.2.3 血清抗体的检测5
2 结果与分析5
2.1 免疫后不同时间的抗体水平比较5
2.2 免疫后不同组别的抗体水平比较7
3 讨论 7
致谢8
参考文献8
不同佐剂对TMUV灭活疫苗免疫效果的比较
引言
2010年4月以来，中国福建省、河北省、浙江省、山东省、江苏省、北京市、上海市等多个地区饲养的种鸭和蛋鸭陆续暴发了一种以产蛋骤然大幅下降，甚至停产为主要临床特征，并伴有食欲急剧减退、高热、运动障碍，排绿色粪便的急性传染病。
病原学调查研究表明该病由一种黄病毒科（Flaviviridae）、黄病毒属（Flavivirus）的坦布 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
苏病毒（Tembusu virus）感染引起[1]。TMUV(坦布苏病毒，Tembusu virus)病毒粒子呈球形，直径多数为45~50nm，有囊膜，囊膜内为20面体对称的核衣壳蛋白，表面有纤突，在感染细胞的胞浆内复制。TMUV对乙醚、氯仿及去氧胆酸盐敏感，对酸碱敏感，pH值在11以上就会失活。且该病毒不耐热，50℃以上加热60min活性丧失。TMUV不能凝集鸡、鸭、鹅、鼠、兔、猪和人的红细胞[2]。
TMUV是在我国首次发现的对水禽致病的新型黄病毒，传播迅速、对鸭鹅危害大，应引起广泛关注。感染鸭主要表现为采食量突然迅速下降，较正常鸭采食量下降40%-50%，随之产蛋率大幅度下降，由高峰期的90%降至10%左右，群内发病率达100%，病死率为5%-15%[3]。鸭发病后体温升高，排绿色稀粪，在感染的后期，出现腿瘫、站立不稳、行走时双脚向外叉开，呈八字脚，翻滚，转圈等神经症状。剖检病鸭腺胃出血；心冠脂肪有出血点，心肌外观苍白，白色条纹状坏死，有的心肌内膜出血；肝脏肿大，淤血，表面有针尖状白色坏死点；脾脏肿大、出血，呈大理石样；严重的病理变化主要在卵巢，卵巢出血、破裂，卵泡膜充血、出血，卵泡充血、变性，卵黄变稀，卵黄囊膜出血，卵泡破裂，形成卵黄性腹膜炎；输卵管固有层水肿，有粘液性渗出。表现出神经症状的病鸭则出现脑膜出血、脑组织水肿。病理组织学变化主要有出血性卵巢炎、间质性肝炎、非化脓性脑炎。该病病程约为1个多月，发病后15d-20d采食量开始逐渐恢复，绿色粪便逐渐减少，体温开始降低，产蛋率逐渐回升，有的可恢复到发病前的水平[4]。
目前国内外兽医工作者在 TMUV 研究领域取得了重要进展，完成了病毒的分离鉴定及全基因组测序，其基因组是不分节段的具有感染性的单股正链RNA，由10991nt组成。基因组仅由5端和3端非编码区(UTR) 以及一个开放阅读框(ORF)组成，基因组依次为5-UTR-C-prM-E-NS 1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR-3。5 端有 I 型m7GpppNp帽子结构，UTR长142nt。3端没有i)oly(A)尾巴结构，UTR长618 nt。5端是结构蛋白编码区，3端是非结构蛋白编码区其基因组大约10.5kb，编码3个结构蛋白：荚膜蛋白(C)、外膜蛋白(PrM and M)和囊膜蛋白(E)及7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。通过和其他黄病毒属比较发现TMUV与4Bagaza病毒的亲缘关系最近[5-7]。此外国内外研究者已建立了多种分子生物学检测方法及实验感染模型，如RT-PCR[8],套式RT-PCR[9],荧光定量PCR[10],RT-LAMP[11],血清学检测法[12]等。已有研究证明鸭坦布苏病毒灭活疫苗能够有效诱导抗体和细胞免疫反应[13,14],但有效的治疗措施亦尚未确定，对TMUV灭活疫苗免疫效果方面的研究依然较少。
疫苗佐剂是能够非特异性地改变或增强机体对抗原特异性免疫应答、发挥辅助物质的一类物质，常用的佐剂有白油佐剂，铝胶佐剂，蜂胶佐剂等[15]。细胞因子调节固有免疫和适应性免疫应答，可作为佐剂增强疫苗免疫的效应[16]。其中，白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）在禽病的防治运用最为广泛，可明显提高特异性免疫应答能力。本研究通过比较白油，铝胶，蜂胶，IL-2这些 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
不同佐剂单独使用和联合使用对TMUV灭活疫苗的免疫效果的影响，以期能筛选出免疫效果最佳的佐剂。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 病毒株及实验动物
病毒株为鹅源坦布苏JS804株病毒，由江苏省农业科学院兽医所禽病实验室分离、鉴定、保存。
实验动物为江苏省农业科学院兽医所禽病实验室饲养的产蛋鸡。
1．1．2 主要试剂
白油，铝胶，纯化的坦布苏病毒E结构蛋白包被抗原，已知坦布苏病毒阳性血清，阴性血清，均由江苏省农业科学院兽医研究所禽病实验自行研制及提供；IL-2由大学动物医学院寄生虫实验组提供；蜂胶购自老山药业股份有限公司；酶标二抗为HRP标记的兔抗鸡IgY，购自美国EARTH公司；BSA，TMBS均购自BIOSHARP公司。
1．1．3 主要仪器
立式压力蒸汽灭菌器(SY-450)购自徐州圣业医疗器械有限责任公司；精密电子天平（AA200）购自美国丹佛仪器公司（Denver Instrument）；二级生物安全柜购自西班牙Telsta BioIIA公司；优普超纯水制造系统购自南京优普实验仪器有限公司；高速冷冻离心机购自德国艾本德公司（Eppendorf）；低温冰箱购自海尔公司；电热恒温培养箱(DNP-9162A)购自上海光都仪器设备有限公司；酶标仪（ELx800）购自美国伯腾仪器有限公司（Biotek）。
1．2 方法
1．2．1 不同佐剂的灭活疫苗的制备
1．2．1.1 白油佐剂的灭活疫苗的制备
取TMUV细胞毒解冻，向200mL TMUV细胞毒中加入0.6mL的甲醛，充分混匀，37°C，36h灭活。取47mL白油与3mL司本-80混合，加入0.5g硬脂酸铝，高温灭菌，即为油相，取灭活后的TMUV 25mL，加入1.5mL吐温-80混匀，即为水相，将油相用乳化仪低速搅拌，加入水相，搅拌1min，即制成1号苗。
表5 铝胶+IL-2佐剂组各鸡的抗体效价
摘要：制备不同佐剂的坦布苏毒灭活疫苗，随机选取实验鸡40只，均分成白油组，白油+IL-2组，铝胶组，铝胶+IL-2组，蜂胶组，蜂胶+IL-2组，IL-2组和对照组8个实验组，免疫前，免疫后1周、2周、3周和4周分别采血，用ELISA检测血清中的抗体水平，比较灭活疫苗的免疫效果。结果表明IL-2作为佐剂的灭活疫苗效果最好，优于白油组，白油+IL-2组，铝胶+IL-2组，蜂胶组和蜂胶+IL-2组，铝胶组效果最差。
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关键字:佐剂；坦布苏病毒；灭活疫苗；免疫效果
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言（或绪论）2
1 材料与方法2
1.1 材料 3
1.1.1 病毒株与实验动物3
1.1.2 主要试剂4
1.1.3 主要仪器4
1.2 方法 4
1.2.1 不同佐剂的灭活疫苗的制备4
1.2.1.1 白油佐剂的灭活疫苗的制备4
1.2.1.2 白油+IL-2佐剂的灭活疫苗的制备4
1.2.1.3 铝胶佐剂的灭活疫苗的制备4
1.2.1.4 铝胶+IL-2佐剂的灭活疫苗的制备4
1.2.1.5 蜂胶佐剂的灭活疫苗的制备4
1.2.1.6 蜂胶+IL-2佐剂的灭活疫苗的制备4
1.2.1.7 IL-2佐剂的灭活疫苗的制备4
1.2.2灭活疫苗的接种4
1.2.3 血清抗体的检测5
2 结果与分析5
2.1 免疫后不同时间的抗体水平比较5
2.2 免疫后不同组别的抗体水平比较7
3 讨论 7
致谢8
参考文献8
不同佐剂对TMUV灭活疫苗免疫效果的比较
引言
2010年4月以来，中国福建省、河北省、浙江省、山东省、江苏省、北京市、上海市等多个地区饲养的种鸭和蛋鸭陆续暴发了一种以产蛋骤然大幅下降，甚至停产为主要临床特征，并伴有食欲急剧减退、高热、运动障碍，排绿色粪便的急性传染病。
病原学调查研究表明该病由一种黄病毒科（Flaviviridae）、黄病毒属（Flavivirus）的坦布 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
苏病毒（Tembusu virus）感染引起[1]。TMUV(坦布苏病毒，Tembusu virus)病毒粒子呈球形，直径多数为45~50nm，有囊膜，囊膜内为20面体对称的核衣壳蛋白，表面有纤突，在感染细胞的胞浆内复制。TMUV对乙醚、氯仿及去氧胆酸盐敏感，对酸碱敏感，pH值在11以上就会失活。且该病毒不耐热，50℃以上加热60min活性丧失。TMUV不能凝集鸡、鸭、鹅、鼠、兔、猪和人的红细胞[2]。
TMUV是在我国首次发现的对水禽致病的新型黄病毒，传播迅速、对鸭鹅危害大，应引起广泛关注。感染鸭主要表现为采食量突然迅速下降，较正常鸭采食量下降40%-50%，随之产蛋率大幅度下降，由高峰期的90%降至10%左右，群内发病率达100%，病死率为5%-15%[3]。鸭发病后体温升高，排绿色稀粪，在感染的后期，出现腿瘫、站立不稳、行走时双脚向外叉开，呈八字脚，翻滚，转圈等神经症状。剖检病鸭腺胃出血；心冠脂肪有出血点，心肌外观苍白，白色条纹状坏死，有的心肌内膜出血；肝脏肿大，淤血，表面有针尖状白色坏死点；脾脏肿大、出血，呈大理石样；严重的病理变化主要在卵巢，卵巢出血、破裂，卵泡膜充血、出血，卵泡充血、变性，卵黄变稀，卵黄囊膜出血，卵泡破裂，形成卵黄性腹膜炎；输卵管固有层水肿，有粘液性渗出。表现出神经症状的病鸭则出现脑膜出血、脑组织水肿。病理组织学变化主要有出血性卵巢炎、间质性肝炎、非化脓性脑炎。该病病程约为1个多月，发病后15d-20d采食量开始逐渐恢复，绿色粪便逐渐减少，体温开始降低，产蛋率逐渐回升，有的可恢复到发病前的水平[4]。
目前国内外兽医工作者在 TMUV 研究领域取得了重要进展，完成了病毒的分离鉴定及全基因组测序，其基因组是不分节段的具有感染性的单股正链RNA，由10991nt组成。基因组仅由5端和3端非编码区(UTR) 以及一个开放阅读框(ORF)组成，基因组依次为5-UTR-C-prM-E-NS 1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR-3。5 端有 I 型m7GpppNp帽子结构，UTR长142nt。3端没有i)oly(A)尾巴结构，UTR长618 nt。5端是结构蛋白编码区，3端是非结构蛋白编码区其基因组大约10.5kb，编码3个结构蛋白：荚膜蛋白(C)、外膜蛋白(PrM and M)和囊膜蛋白(E)及7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。通过和其他黄病毒属比较发现TMUV与4Bagaza病毒的亲缘关系最近[5-7]。此外国内外研究者已建立了多种分子生物学检测方法及实验感染模型，如RT-PCR[8],套式RT-PCR[9],荧光定量PCR[10],RT-LAMP[11],血清学检测法[12]等。已有研究证明鸭坦布苏病毒灭活疫苗能够有效诱导抗体和细胞免疫反应[13,14],但有效的治疗措施亦尚未确定，对TMUV灭活疫苗免疫效果方面的研究依然较少。
疫苗佐剂是能够非特异性地改变或增强机体对抗原特异性免疫应答、发挥辅助物质的一类物质，常用的佐剂有白油佐剂，铝胶佐剂，蜂胶佐剂等[15]。细胞因子调节固有免疫和适应性免疫应答，可作为佐剂增强疫苗免疫的效应[16]。其中，白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）在禽病的防治运用最为广泛，可明显提高特异性免疫应答能力。本研究通过比较白油，铝胶，蜂胶，IL-2这些 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
不同佐剂单独使用和联合使用对TMUV灭活疫苗的免疫效果的影响，以期能筛选出免疫效果最佳的佐剂。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 病毒株及实验动物
病毒株为鹅源坦布苏JS804株病毒，由江苏省农业科学院兽医所禽病实验室分离、鉴定、保存。
实验动物为江苏省农业科学院兽医所禽病实验室饲养的产蛋鸡。
1．1．2 主要试剂
白油，铝胶，纯化的坦布苏病毒E结构蛋白包被抗原，已知坦布苏病毒阳性血清，阴性血清，均由江苏省农业科学院兽医研究所禽病实验自行研制及提供；IL-2由大学动物医学院寄生虫实验组提供；蜂胶购自老山药业股份有限公司；酶标二抗为HRP标记的兔抗鸡IgY，购自美国EARTH公司；BSA，TMBS均购自BIOSHARP公司。
1．1．3 主要仪器
立式压力蒸汽灭菌器(SY-450)购自徐州圣业医疗器械有限责任公司；精密电子天平（AA200）购自美国丹佛仪器公司（Denver Instrument）；二级生物安全柜购自西班牙Telsta BioIIA公司；优普超纯水制造系统购自南京优普实验仪器有限公司；高速冷冻离心机购自德国艾本德公司（Eppendorf）；低温冰箱购自海尔公司；电热恒温培养箱(DNP-9162A)购自上海光都仪器设备有限公司；酶标仪（ELx800）购自美国伯腾仪器有限公司（Biotek）。
1．2 方法
1．2．1 不同佐剂的灭活疫苗的制备
1．2．1.1 白油佐剂的灭活疫苗的制备
取TMUV细胞毒解冻，向200mL TMUV细胞毒中加入0.6mL的甲醛，充分混匀，37°C，36h灭活。取47mL白油与3mL司本-80混合，加入0.5g硬脂酸铝，高温灭菌，即为油相，取灭活后的TMUV 25mL，加入1.5mL吐温-80混匀，即为水相，将油相用乳化仪低速搅拌，加入水相，搅拌1min，即制成1号苗。
表5 铝胶+IL-2佐剂组各鸡的抗体效价
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