一株分离于猪场中华按蚊源流行性乙型脑炎病毒的鉴定与序列分析
：为了解上海市蚊源JEV的分子特征，本研究对2014年上海市嘉定区猪场采集的蚊媒样品采用BHK-21和C6/36细胞培养法进行病毒分离，通过RT-PCR和IFA技术对分离株进行鉴定。结果表明，分离到1株JEV，命名为JD-15，源自中华按蚊。JD-15株分别感染BHK-21和C6/36细胞，72h后所有细胞均发生病变(CPE)。对JD-15株的E基因进行克隆测序及进化分析，结果表明，该株JEV属于基因Ⅲ型，与减毒活疫苗株SA-14-14-2株E基因段核苷酸同源性为98.1%，氨基酸同源性为97.5%。本研究为乙型脑炎的流行病学调查提供了科学依据，对上海市蚊虫及蚊媒病的防治具有重要意义。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1引物设计及合成2
1.1.2细胞和蚊媒样品2
1.1.3实验器材2
1.1.4主要试剂3
1.2方法 3
1.2.1蚊虫样本的采集及处理3
1.2.2病毒的分离与培养3
1.2.3 RTPCR鉴定3
1.2.4间接免疫荧光染色试验4
1.2.5 TCID50测定4
1.2.6 序列分析4
2结果与分析5
2.1蚊虫样本的采集5
2.2细胞病变的观察5
2.3 RTPCR鉴定6
2.4间接免疫荧光染色试验7
2.5 TCID50测定7
2.6序列分析8
2.6.1核苷酸序列分析8
2.6.2氨基酸序列分析8
2.6.3分子进化分析9
3讨论10
致谢12
参考文献12
一株分
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
离于上海猪场中华按蚊源流行性乙型脑炎病毒的鉴定与序列分析
引言
流行性乙型脑炎又称日本乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)，简称乙脑，是由流行性乙型脑炎病毒(JEV)引起的一种自然疫源性疾病。该病具有明显的季节性，主要由三带喙库蚊等吸血蚊虫传播，故高发于蚊虫大量繁殖的夏秋季节。乙型脑炎作为一种蚊媒性人兽共患传染病对猪的致死性不高，但可导致怀孕母猪高热、流产和死胎，公猪出现睾丸炎，给养猪业造成巨大经济损失[1]。该病可通过蚊虫叮咬传染给人，造成人的中枢神经系统疾病，严重威胁人类健康，已日益成为重要的公共卫生问题。
1871年，JEV首先在日本发现，并于1935年从患有乙型脑炎死亡病人、死马的脑组织和蚊虫中分离到该病毒，首次确定了乙型脑炎的病原，20世纪40年代经血清学鉴定和病毒分离证实乙脑在中国流行，并从北京市乙脑病例中分离到JEV，随后陆续从我国其他地区分离到数百株JEV[2]。近年来我国乙脑的发病率较低，且呈下降趋势，北京、上海、江苏、浙江、福建、广东等历史上乙脑高流行省的发病率均有明显下降，而目前的主要高发省份为贵州、重庆、云南、河南、四川、安徽和陕西等[3]。当前乙脑流行地区和流行趋势的变迁与疫苗的研制使用和以预防为主的综合防治措施的实施密切相关。
全世界分离的JEV可分为5个基因型（I、II、III、IV和V型），我国已经分离到3个基因型（基因I、III和V型）的JEV[4]，并正在形成以基因I型为优势基因型的趋势。我国于2001年首先在上海市奉贤区采集的三带喙库蚊标本中分离到7株基因I型JEV，此后多个省相继从蚊虫中分离到基因I型毒株[5]。由于JEV是单股正链RNA病毒，其基因组的复制缺乏校正机制，故而进化速度较快。分子流行病学调查显示，同一地区JEV的基因型分布已不呈单一分布。目前，上海市呈现基因I型和III型共同流行趋势[6]。
乙型脑炎病毒属于黄病毒科黄病毒属的成员，其基因组由5端非编码区，一个几乎跨越整个基因组的单一开放阅读框（ORF）和3端非编码区构成，无亚基因组结构。ORF大小约10.3kb，编码一个多聚蛋白前体，经宿主、病毒蛋白酶切割加工，产生3个结构蛋白：核心蛋白（C）、膜蛋白（prM/M）、囊膜糖蛋白（E）、7个非结构蛋白（NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b，NS5）[7]。其中E蛋白是病毒颗粒表面最重要的成分之一，与病毒的细胞嗜性和毒力密切相关，在中和抗体的产生和保护性免疫中发挥重要作用[8]。
本研究对2014年采集自上海市嘉定区猪场的蚊子样品进行检测，从蚊虫样品中成功分离得到1株JEV，命名为JD15株，并对其E蛋白的基因序列进行测定和分析，通过比对分离毒株与参考毒株的核苷酸序列和氨基酸序列，并且基于E基因序列构建进化树来了解分离株的分子生物学特征和分子进化情况。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 引物设计及合成 囊膜糖蛋白E是JEV最重要的结构蛋白，包含病毒的多个抗原表位、受体结合位点及高度保守区，与病毒的毒力密切相关，参与病毒粒子的装配、结合受体、穿入等重要生物学过程，故本研究针对E基因和全长基因设计了特异性引物进行后续试验，引物均由Invitrogen公司合成。
参考GenBank中已发表的JEV SA14142株的核苷酸序列，利用Primer 5.0软件设计JEV 特异性引物，引物信息见表1。
表1 引物信息
Table1. The information of primer
引物 序列 位置/bp 长度/nt
Primer Sequence Location Length
E957F 5’TTGGTCGCTCCGGCTTACA3’ 957975 475
E1400R 5’GGTTTTCCGAAGTGGTGGTTC3’ 14221400
JE955F 5’TGYTGGTCGCTCCGGCTTA3’ 955973 1500
JE2481R 5’GATGTCAATGGCACATCCAGT3’ 24612481
1．1．2 细胞和蚊媒样品 金黄地鼠肾细胞BHK21(Baby hamster kidney cell)、白蚊伊蚊卵细胞(C6/36)均由中国农业科学院上海兽医研究所猪繁殖与呼吸障碍综合征病研究实验室传代保存。蚊媒样品于2014年在上海市嘉定区多个猪场利用紫外捕蚊灯采集。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1引物设计及合成2
1.1.2细胞和蚊媒样品2
1.1.3实验器材2
1.1.4主要试剂3
1.2方法 3
1.2.1蚊虫样本的采集及处理3
1.2.2病毒的分离与培养3
1.2.3 RTPCR鉴定3
1.2.4间接免疫荧光染色试验4
1.2.5 TCID50测定4
1.2.6 序列分析4
2结果与分析5
2.1蚊虫样本的采集5
2.2细胞病变的观察5
2.3 RTPCR鉴定6
2.4间接免疫荧光染色试验7
2.5 TCID50测定7
2.6序列分析8
2.6.1核苷酸序列分析8
2.6.2氨基酸序列分析8
2.6.3分子进化分析9
3讨论10
致谢12
参考文献12
一株分
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
离于上海猪场中华按蚊源流行性乙型脑炎病毒的鉴定与序列分析
引言
流行性乙型脑炎又称日本乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)，简称乙脑，是由流行性乙型脑炎病毒(JEV)引起的一种自然疫源性疾病。该病具有明显的季节性，主要由三带喙库蚊等吸血蚊虫传播，故高发于蚊虫大量繁殖的夏秋季节。乙型脑炎作为一种蚊媒性人兽共患传染病对猪的致死性不高，但可导致怀孕母猪高热、流产和死胎，公猪出现睾丸炎，给养猪业造成巨大经济损失[1]。该病可通过蚊虫叮咬传染给人，造成人的中枢神经系统疾病，严重威胁人类健康，已日益成为重要的公共卫生问题。
1871年，JEV首先在日本发现，并于1935年从患有乙型脑炎死亡病人、死马的脑组织和蚊虫中分离到该病毒，首次确定了乙型脑炎的病原，20世纪40年代经血清学鉴定和病毒分离证实乙脑在中国流行，并从北京市乙脑病例中分离到JEV，随后陆续从我国其他地区分离到数百株JEV[2]。近年来我国乙脑的发病率较低，且呈下降趋势，北京、上海、江苏、浙江、福建、广东等历史上乙脑高流行省的发病率均有明显下降，而目前的主要高发省份为贵州、重庆、云南、河南、四川、安徽和陕西等[3]。当前乙脑流行地区和流行趋势的变迁与疫苗的研制使用和以预防为主的综合防治措施的实施密切相关。
全世界分离的JEV可分为5个基因型（I、II、III、IV和V型），我国已经分离到3个基因型（基因I、III和V型）的JEV[4]，并正在形成以基因I型为优势基因型的趋势。我国于2001年首先在上海市奉贤区采集的三带喙库蚊标本中分离到7株基因I型JEV，此后多个省相继从蚊虫中分离到基因I型毒株[5]。由于JEV是单股正链RNA病毒，其基因组的复制缺乏校正机制，故而进化速度较快。分子流行病学调查显示，同一地区JEV的基因型分布已不呈单一分布。目前，上海市呈现基因I型和III型共同流行趋势[6]。
乙型脑炎病毒属于黄病毒科黄病毒属的成员，其基因组由5端非编码区，一个几乎跨越整个基因组的单一开放阅读框（ORF）和3端非编码区构成，无亚基因组结构。ORF大小约10.3kb，编码一个多聚蛋白前体，经宿主、病毒蛋白酶切割加工，产生3个结构蛋白：核心蛋白（C）、膜蛋白（prM/M）、囊膜糖蛋白（E）、7个非结构蛋白（NS1，NS2a，NS2b，NS3，NS4a，NS4b，NS5）[7]。其中E蛋白是病毒颗粒表面最重要的成分之一，与病毒的细胞嗜性和毒力密切相关，在中和抗体的产生和保护性免疫中发挥重要作用[8]。
本研究对2014年采集自上海市嘉定区猪场的蚊子样品进行检测，从蚊虫样品中成功分离得到1株JEV，命名为JD15株，并对其E蛋白的基因序列进行测定和分析，通过比对分离毒株与参考毒株的核苷酸序列和氨基酸序列，并且基于E基因序列构建进化树来了解分离株的分子生物学特征和分子进化情况。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 引物设计及合成 囊膜糖蛋白E是JEV最重要的结构蛋白，包含病毒的多个抗原表位、受体结合位点及高度保守区，与病毒的毒力密切相关，参与病毒粒子的装配、结合受体、穿入等重要生物学过程，故本研究针对E基因和全长基因设计了特异性引物进行后续试验，引物均由Invitrogen公司合成。
参考GenBank中已发表的JEV SA14142株的核苷酸序列，利用Primer 5.0软件设计JEV 特异性引物，引物信息见表1。
表1 引物信息
Table1. The information of primer
引物 序列 位置/bp 长度/nt
Primer Sequence Location Length
E957F 5’TTGGTCGCTCCGGCTTACA3’ 957975 475
E1400R 5’GGTTTTCCGAAGTGGTGGTTC3’ 14221400
JE955F 5’TGYTGGTCGCTCCGGCTTA3’ 955973 1500
JE2481R 5’GATGTCAATGGCACATCCAGT3’ 24612481
1．1．2 细胞和蚊媒样品 金黄地鼠肾细胞BHK21(Baby hamster kidney cell)、白蚊伊蚊卵细胞(C6/36)均由中国农业科学院上海兽医研究所猪繁殖与呼吸障碍综合征病研究实验室传代保存。蚊媒样品于2014年在上海市嘉定区多个猪场利用紫外捕蚊灯采集。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/859.html
