17株兔源多杀性巴氏杆菌抗生素耐药性及耐药基因分析
兔巴氏杆菌病是由兔多杀性巴氏杆菌引起的一种家兔养殖业中最常见的传染病。本试验从遗传型和表现型两个角度出发，对分离自江苏、山东地区不同兔场的17株多杀性巴氏杆菌进行耐药性研究和分析，包括药敏试验、相关耐药基因的检测。试验结果表明，17株兔源多杀性巴氏杆菌菌株均耐2种或2种以上的抗生素，不同兔场分离菌株的耐药情况不同，最多可同时耐15种抗生素，对四环素耐药表现最严重，耐药率超过90%；其次是氨基糖苷类的链霉素，耐药率在80%以上；对氟苯尼考、环丙沙星和恩诺沙星的敏感性最高。除四环素之外的其他抗生素的耐药基因检测结果与耐药表现型基本相符，以blatem-1、aadA1、sul1、sul2的检出率最高。本试验通过研究各耐药相关因子与巴氏杆氏菌多重耐药菌株之间的关系，分析巴氏杆菌的耐药情况，为兔场临床用药提供理论依据，为多重耐药（multidrug resistance,MDR）机制的研究提供参考数据。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株 2
1.1.2 主要试剂 2
1.1.3 主要仪器设备 2
1.1.4 耐药基因引物 2
1.2 方法 3
1.2.1 菌液的准备 3
1.2.2 培养基的制备 3
1.2.3 药敏试验 3
1.2.4 耐药基因检测 4
2 结果与分析 5
2.1 药敏试验结果 5
2.2 耐药基因检测结果 7
2.2.1 β内酰胺类耐药基因 7
2.2.2 氨基糖苷类耐药基因 7
2.2.3 磺胺类耐药基因 8
2.2.4 四环素类耐药基因 9
3 讨论 10
致谢 10
参考文献 11
17株兔源多杀性巴氏杆菌抗生素耐药性及耐药基因分析
引言
兔巴氏杆菌病（Pasteurellosis）是由兔多杀性巴氏杆菌（Pasteurel *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
la multocida，Pm）引起的兔急性出血性败血症[1]。该病的病型主要有：鼻炎型、肺炎型、中耳炎型[2]，多有两种或两种以上同时发生[3]。除上述病型外，生殖器官感染主要表现为母兔子宫炎的子宫积脓，公兔睾丸炎和附睾炎[4]。我国将巴氏杆菌列为三类病原微生物。在临床上，兔巴氏杆菌病常给家兔养殖业造成严重的经济损失。
20世纪90年代以来，随着抗生素无节制且不合理的使用，巴氏杆菌的耐药菌株不断出现，其多重耐药已经引起社会的广泛关注。目前，许多国内外的临床工作者积极开展巴氏杆菌的耐药性研究。Dwight C Hirsh等在美国加州的戴维斯市从临床上分离得到5株禽源Pm，结果表明，有3株对链霉素耐药，4株对磺胺嘧啶耐药，耐药株的最小抑菌浓度( minimum inhibitory concentration，MIC) 均大于128 μg/mL[5]。Cardenas M等在西班牙分离得到1株对喹诺酮敏感的羊源Pm，用逐渐增加抗生素浓度的方法进行诱导培养，其诱导后的菌株MIC增加了10倍以上[6]。Kehrenberg C等在德国从临床上分离得到牛源Pm，并进行药敏试验，结果显示所分离的菌株均对氯霉素和氟苯尼考耐药，其MIC分别为32 μg/mL和16 μg/mL[7]。San Millan A等从西班牙的首都马德里分离到禽源Pm，结果发现其中对β－内酰胺耐药的菌株都伴随着对链霉素、四环素、磺胺类耐药，且耐药的菌株对阿莫西林和磺胺类药物的MIC高达256 μg/mL[8]。
在国内关于巴氏杆菌的耐药性研究中，金天明等在吉林地区分离到禽源Pm，并应用26种临床常用药物对分离菌株进行药物敏感性试验，结果显示，该菌株对头孢氨苄、头孢唑啉、庆大霉素、复方新诺明、四环素、依诺沙星等21种抗生素产生耐药性[9]。Tang X等分离得到233株猪源Pm，并对20种抗生素做了药敏试验，结果表明，70%的菌株对阿莫西林、林可霉素、磺胺二嘧啶、复方新诺明呈高度耐药；20%的菌株对大观霉素、卡那霉素、新霉素、庆大霉素、替米考星耐药，其中对阿莫西林、大观霉素、替米考星、四环素、盐酸环丙沙星的MIC已达128 μg/mL[10]。自2010年以来，吉林农业大学动物科技学院实验室从我国吉林、内蒙古、湖北、河北等省份分离得到牛源多杀性巴氏杆菌12株，耐药性检测结果显示，所有菌株均对链霉素和新诺明高度耐药，其MIC均大于256 μg/mL，其中，吉林和湖北的分离菌株对临床治疗常用的喹诺酮类和大环内酯类抗生素亦产生了耐药性，其MIC均为64 μg/mL[11]。刘梅等在桂林某兔场分离得到1株兔源多杀性巴氏杆菌，药敏试验所检测的22种抗生素中仅对8种抗生素敏感，对大部分的常用抗生素耐药包括阿莫西林、氨苄西林、新霉素、庆大霉素、阿米卡星、强力霉素、四环素、替米考星、多粘菌素B、林可霉素等[12]。
目前，对于猪源、禽源、牛源的多杀性巴氏杆菌的耐药研究较多，而关于兔源多杀性巴氏杆菌研究较少，因此，本文主要针对兔源多杀性巴氏杆菌对β－内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类、四环素类药物的耐药情况、相关的耐药基因分布情况进行研究分析。
对深入研究多杀性巴氏杆菌的耐药性，获得更好的药物治疗效果，具有重要的临床用药指导意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
江苏省农科院兽医所兔病实验室分离自山东、江苏等不同兔场的多杀性巴氏杆菌17株。其中4株分离甲兔场，10株分离乙兔场，3株分离自其他兔场。（分别编号为1~17）
1.1.2 主要试剂
改良马丁肉汤培养基 购自青岛高科园海博生物科技有限公司；rTaq酶、10×PCR buffer、dNTP 购自TaKaRa公司；细菌基因组DNA提取试剂盒 购自TIANGEN公司；2×HighFidelity Master Mix 购自南京擎科生物科技有限公司；抗菌药物药敏纸片 购自杭州微生物试剂有限公司；小牛血清、小牛全血 亲自采集；其余试剂均为国产分析纯。
1.1.3 主要仪器设备
涡旋振荡器、梯度PCR仪、电动移液器、移液枪（2.5~1000 μL）、高速低温离心机 购自德国Eppendorf公司；水平式电泳装置、电泳仪 购自上海培清科技有限公司；
Tanon 2500全自动数码凝胶图像分析系统 购自上海天能科技有限公司；恒温温箱、微波炉 购自上海森信实验仪器有限公司；日本TOMY高压灭菌器（SX500） 购自日本Tomy Digital Biology公司；游标卡尺；三角玻璃棒。
1.1.4 耐药基因的引物[13]
均由南京擎科生物科技有限公司合成。(表11)
表11 9对耐药基因引物
Table 11 9 resistance gene primers
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株 2
1.1.2 主要试剂 2
1.1.3 主要仪器设备 2
1.1.4 耐药基因引物 2
1.2 方法 3
1.2.1 菌液的准备 3
1.2.2 培养基的制备 3
1.2.3 药敏试验 3
1.2.4 耐药基因检测 4
2 结果与分析 5
2.1 药敏试验结果 5
2.2 耐药基因检测结果 7
2.2.1 β内酰胺类耐药基因 7
2.2.2 氨基糖苷类耐药基因 7
2.2.3 磺胺类耐药基因 8
2.2.4 四环素类耐药基因 9
3 讨论 10
致谢 10
参考文献 11
17株兔源多杀性巴氏杆菌抗生素耐药性及耐药基因分析
引言
兔巴氏杆菌病（Pasteurellosis）是由兔多杀性巴氏杆菌（Pasteurel *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
la multocida，Pm）引起的兔急性出血性败血症[1]。该病的病型主要有：鼻炎型、肺炎型、中耳炎型[2]，多有两种或两种以上同时发生[3]。除上述病型外，生殖器官感染主要表现为母兔子宫炎的子宫积脓，公兔睾丸炎和附睾炎[4]。我国将巴氏杆菌列为三类病原微生物。在临床上，兔巴氏杆菌病常给家兔养殖业造成严重的经济损失。
20世纪90年代以来，随着抗生素无节制且不合理的使用，巴氏杆菌的耐药菌株不断出现，其多重耐药已经引起社会的广泛关注。目前，许多国内外的临床工作者积极开展巴氏杆菌的耐药性研究。Dwight C Hirsh等在美国加州的戴维斯市从临床上分离得到5株禽源Pm，结果表明，有3株对链霉素耐药，4株对磺胺嘧啶耐药，耐药株的最小抑菌浓度( minimum inhibitory concentration，MIC) 均大于128 μg/mL[5]。Cardenas M等在西班牙分离得到1株对喹诺酮敏感的羊源Pm，用逐渐增加抗生素浓度的方法进行诱导培养，其诱导后的菌株MIC增加了10倍以上[6]。Kehrenberg C等在德国从临床上分离得到牛源Pm，并进行药敏试验，结果显示所分离的菌株均对氯霉素和氟苯尼考耐药，其MIC分别为32 μg/mL和16 μg/mL[7]。San Millan A等从西班牙的首都马德里分离到禽源Pm，结果发现其中对β－内酰胺耐药的菌株都伴随着对链霉素、四环素、磺胺类耐药，且耐药的菌株对阿莫西林和磺胺类药物的MIC高达256 μg/mL[8]。
在国内关于巴氏杆菌的耐药性研究中，金天明等在吉林地区分离到禽源Pm，并应用26种临床常用药物对分离菌株进行药物敏感性试验，结果显示，该菌株对头孢氨苄、头孢唑啉、庆大霉素、复方新诺明、四环素、依诺沙星等21种抗生素产生耐药性[9]。Tang X等分离得到233株猪源Pm，并对20种抗生素做了药敏试验，结果表明，70%的菌株对阿莫西林、林可霉素、磺胺二嘧啶、复方新诺明呈高度耐药；20%的菌株对大观霉素、卡那霉素、新霉素、庆大霉素、替米考星耐药，其中对阿莫西林、大观霉素、替米考星、四环素、盐酸环丙沙星的MIC已达128 μg/mL[10]。自2010年以来，吉林农业大学动物科技学院实验室从我国吉林、内蒙古、湖北、河北等省份分离得到牛源多杀性巴氏杆菌12株，耐药性检测结果显示，所有菌株均对链霉素和新诺明高度耐药，其MIC均大于256 μg/mL，其中，吉林和湖北的分离菌株对临床治疗常用的喹诺酮类和大环内酯类抗生素亦产生了耐药性，其MIC均为64 μg/mL[11]。刘梅等在桂林某兔场分离得到1株兔源多杀性巴氏杆菌，药敏试验所检测的22种抗生素中仅对8种抗生素敏感，对大部分的常用抗生素耐药包括阿莫西林、氨苄西林、新霉素、庆大霉素、阿米卡星、强力霉素、四环素、替米考星、多粘菌素B、林可霉素等[12]。
目前，对于猪源、禽源、牛源的多杀性巴氏杆菌的耐药研究较多，而关于兔源多杀性巴氏杆菌研究较少，因此，本文主要针对兔源多杀性巴氏杆菌对β－内酰胺类、氨基糖苷类、磺胺类、四环素类药物的耐药情况、相关的耐药基因分布情况进行研究分析。
对深入研究多杀性巴氏杆菌的耐药性，获得更好的药物治疗效果，具有重要的临床用药指导意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株
江苏省农科院兽医所兔病实验室分离自山东、江苏等不同兔场的多杀性巴氏杆菌17株。其中4株分离甲兔场，10株分离乙兔场，3株分离自其他兔场。（分别编号为1~17）
1.1.2 主要试剂
改良马丁肉汤培养基 购自青岛高科园海博生物科技有限公司；rTaq酶、10×PCR buffer、dNTP 购自TaKaRa公司；细菌基因组DNA提取试剂盒 购自TIANGEN公司；2×HighFidelity Master Mix 购自南京擎科生物科技有限公司；抗菌药物药敏纸片 购自杭州微生物试剂有限公司；小牛血清、小牛全血 亲自采集；其余试剂均为国产分析纯。
1.1.3 主要仪器设备
涡旋振荡器、梯度PCR仪、电动移液器、移液枪（2.5~1000 μL）、高速低温离心机 购自德国Eppendorf公司；水平式电泳装置、电泳仪 购自上海培清科技有限公司；
Tanon 2500全自动数码凝胶图像分析系统 购自上海天能科技有限公司；恒温温箱、微波炉 购自上海森信实验仪器有限公司；日本TOMY高压灭菌器（SX500） 购自日本Tomy Digital Biology公司；游标卡尺；三角玻璃棒。
1.1.4 耐药基因的引物[13]
均由南京擎科生物科技有限公司合成。(表11)
表11 9对耐药基因引物
Table 11 9 resistance gene primers
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