赛鸽新城疫病毒分离株hn基因分析及原核表达
HN蛋白（血凝素-神经氨酸酶蛋白）是构成新城疫病毒(NDV)囊膜上较大纤突的糖蛋白，也是病毒的重要宿主保护性抗原，在病毒吸附宿主细胞，促进F蛋白与细胞膜的融合以及病毒粒子从宿主细胞内的释放过程中均发挥重要作用。本研究是利用南京市某赛鸽公棚的发病鸽脑组织中分离到的一株鸽新城疫病毒（命名为Pi/NJ/CH/4416/2016，简称ND4416）。采用RT-PCR技术扩增并测序了分离株的HN基因序列，然后与我国东部多个省市近年来发生的鸽新城疫HN基因序列进行对比分析，比较不同地区鸽源新城疫病毒同源性及各分离株之间的进化关系，推测该毒株的可能来源。利用大肠杆菌表达系统对ND4416株HN基因进行诱导表达，并对表达条件进行探索和优化诱导。本研究结果表明该毒株HN基因与上海分离到的毒株同源性较高，HN基因成功表达且在30℃诱导6h的条件下表达量最大。本研究在后续研发专用的鸽新城疫疫苗的过程中起基础作用，同时为鸽新城疫的预防和治疗提供帮助。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 质粒及细胞2
1.1.2 主要材料及试剂2
1.1.3 仪器及设备2
1.2 方法 2
1.2.1 HN基因序列分析2
1.2.2 质粒的提取3
1.2.3 质粒的双酶切4
1.2.4 双酶切结果的检验和质粒的回收4
1.2.5 重组质粒的构建4
1.2.6 感受态大肠杆菌BL21制备4
1.2.7 质粒转化感受态大肠杆菌BL214
1.2.8 重组表达菌的IPTG诱导表达5
1.2.9 SDSPAGE电泳分析表达产物5
1.2.10 重组蛋白的WesternBlot鉴定5
1.2.11 曝光5
2 结果与分析5
2.1 HN基因分析5
2.2 HN基因重组质粒表达分析7
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
2.2.1 重组质粒诱导表达7
2.2.2 表达产物可溶性分析7
2.2.3 重组蛋白表达条件优化7
2.3 重组蛋白的WesternBlot鉴定8
3 讨论9
致谢10
参考文献10
赛鸽新城疫病毒南京分离株HN基因分析及原核表达
引言
引言
鸽新城疫（Pigeon Newcastle disease, ND）又名鸽瘟，是由鸽 Ⅰ 型副黏病毒（Pigeon Paramyxovirus typeⅠ, PPMV1）（又称为鸽新城疫病毒）引起的一种以肠炎、腹泻和神经症状为特征、严重危害鸽养殖业的急性、烈性、高度接触性、病毒性传染病[12]。鸽新城疫1977年起源于伊拉克，随后在埃及、意大利、比利时、德国迅速传播开来。1983年，英国开始发生鸽新城疫并发生大范围的传播[36]。1985年前后，该病开始呈世界性传播，在欧洲大部分地区以及亚、非、北美部分地区的赛鸽和野生鸽体内可以分离到新城疫病毒[79]。鸽新城疫于80年代传入我国，并在我国各地大范围流行，由于目前没有专门针对鸽源新城疫的商品化疫苗，该病的防控存在较大难度，对鸽养殖业危害较为严重。
鸽新城疫病毒（PPMV1）属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒亚科（Paramyxovirinae）、禽腮腺炎病毒属（AvuLuvirus），是一种单股、负链、不分节段的RNA病毒，基因组长度为15186或15192 nt，分子量约为557KDa，编码核蛋白（NP），磷蛋白（P），基质蛋白（M），融合蛋白（F），血凝素神经氨酸酶蛋白（HN）及大聚合酶蛋白(L)六种结构蛋白[1012]。其中HN蛋白是构成鸽新城疫病毒囊膜上较大纤突的糖蛋白，也是病毒的重要宿主保护性抗原，在病毒吸附宿主细胞，促进F蛋白与细胞膜的融合以及病毒粒子从宿主细胞内的释放过程中均发挥重要作用。
本研究对南京分离的一株鸽新城疫病毒HN基因进行序列分析，通过构建遗传系统发育树推测其遗传起源及其与近年来国内流行的鸽源新城疫毒株之间的亲缘关系。此外还利用大肠杆菌表达系统对HN蛋白进行表达，以期为研发专用的鸽新城疫疫苗做基础，同时为该病的防控和治疗提供帮助[13]。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 质粒及细胞
鸽新城疫Pi/NJ/CH/4416/2016株HN基因，pET32a质粒均由实验室保存。实验室常备大肠杆菌BL21（DE3）。
1．1．2 主要材料及试剂
限制性内切酶BamH I和Xho I，T4连接酶，蛋白Marker，βD半乳糖苷（IPTG），ECL化学发光试剂盒，质粒小提试剂盒，琼脂糖凝胶/PCR产物纯化试剂盒，HisTag单克隆抗体，辣根过氧化氢物酶标记山羊抗小鼠IgG，30%聚丙烯酰胺，10%过硫酸铵（APS)，5× SDSPAGE Loading buffer，考马斯亮蓝染色液，甲醇脱色液，转印缓冲液等。
1．1．3 仪器及设备
超净工作台，全波长酶标仪，漩涡混匀器，水浴锅，恒温振荡器，高速离心机，水平摇床，电泳仪，半干转印槽，分光光度计等。
1．2 方法
1．2．1 HN基因序列分析
1．2．1．1 引物设计
参照已发表的鸽新城疫毒株Pi/SH/CH/0168/2013（KT163263.1）全基因序列，利用Premier5.0软件设计扩增HN基因的引物F3/F4。HN基因目的产物大小为2186bp，引物由金唯智生物科技有限公司合成，设计的引物序列如下：
F3：5 TGACAACCTGTTCAATGG3
F4：5 ATAGATGTGACTCTGGTAGGAT3
1．2．1．2 病毒RNA的提取
将发病鸽脑组织做匀浆处理，按TaKaRa Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 5.0(TaKaRa)试剂盒说明书上的操作步骤进行病毒RNA的提取。
1．2．1．3 反转录聚合酶链式反应（RTPCR）检测
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 质粒及细胞2
1.1.2 主要材料及试剂2
1.1.3 仪器及设备2
1.2 方法 2
1.2.1 HN基因序列分析2
1.2.2 质粒的提取3
1.2.3 质粒的双酶切4
1.2.4 双酶切结果的检验和质粒的回收4
1.2.5 重组质粒的构建4
1.2.6 感受态大肠杆菌BL21制备4
1.2.7 质粒转化感受态大肠杆菌BL214
1.2.8 重组表达菌的IPTG诱导表达5
1.2.9 SDSPAGE电泳分析表达产物5
1.2.10 重组蛋白的WesternBlot鉴定5
1.2.11 曝光5
2 结果与分析5
2.1 HN基因分析5
2.2 HN基因重组质粒表达分析7
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
2.2.1 重组质粒诱导表达7
2.2.2 表达产物可溶性分析7
2.2.3 重组蛋白表达条件优化7
2.3 重组蛋白的WesternBlot鉴定8
3 讨论9
致谢10
参考文献10
赛鸽新城疫病毒南京分离株HN基因分析及原核表达
引言
引言
鸽新城疫（Pigeon Newcastle disease, ND）又名鸽瘟，是由鸽 Ⅰ 型副黏病毒（Pigeon Paramyxovirus typeⅠ, PPMV1）（又称为鸽新城疫病毒）引起的一种以肠炎、腹泻和神经症状为特征、严重危害鸽养殖业的急性、烈性、高度接触性、病毒性传染病[12]。鸽新城疫1977年起源于伊拉克，随后在埃及、意大利、比利时、德国迅速传播开来。1983年，英国开始发生鸽新城疫并发生大范围的传播[36]。1985年前后，该病开始呈世界性传播，在欧洲大部分地区以及亚、非、北美部分地区的赛鸽和野生鸽体内可以分离到新城疫病毒[79]。鸽新城疫于80年代传入我国，并在我国各地大范围流行，由于目前没有专门针对鸽源新城疫的商品化疫苗，该病的防控存在较大难度，对鸽养殖业危害较为严重。
鸽新城疫病毒（PPMV1）属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒亚科（Paramyxovirinae）、禽腮腺炎病毒属（AvuLuvirus），是一种单股、负链、不分节段的RNA病毒，基因组长度为15186或15192 nt，分子量约为557KDa，编码核蛋白（NP），磷蛋白（P），基质蛋白（M），融合蛋白（F），血凝素神经氨酸酶蛋白（HN）及大聚合酶蛋白(L)六种结构蛋白[1012]。其中HN蛋白是构成鸽新城疫病毒囊膜上较大纤突的糖蛋白，也是病毒的重要宿主保护性抗原，在病毒吸附宿主细胞，促进F蛋白与细胞膜的融合以及病毒粒子从宿主细胞内的释放过程中均发挥重要作用。
本研究对南京分离的一株鸽新城疫病毒HN基因进行序列分析，通过构建遗传系统发育树推测其遗传起源及其与近年来国内流行的鸽源新城疫毒株之间的亲缘关系。此外还利用大肠杆菌表达系统对HN蛋白进行表达，以期为研发专用的鸽新城疫疫苗做基础，同时为该病的防控和治疗提供帮助[13]。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 质粒及细胞
鸽新城疫Pi/NJ/CH/4416/2016株HN基因，pET32a质粒均由实验室保存。实验室常备大肠杆菌BL21（DE3）。
1．1．2 主要材料及试剂
限制性内切酶BamH I和Xho I，T4连接酶，蛋白Marker，βD半乳糖苷（IPTG），ECL化学发光试剂盒，质粒小提试剂盒，琼脂糖凝胶/PCR产物纯化试剂盒，HisTag单克隆抗体，辣根过氧化氢物酶标记山羊抗小鼠IgG，30%聚丙烯酰胺，10%过硫酸铵（APS)，5× SDSPAGE Loading buffer，考马斯亮蓝染色液，甲醇脱色液，转印缓冲液等。
1．1．3 仪器及设备
超净工作台，全波长酶标仪，漩涡混匀器，水浴锅，恒温振荡器，高速离心机，水平摇床，电泳仪，半干转印槽，分光光度计等。
1．2 方法
1．2．1 HN基因序列分析
1．2．1．1 引物设计
参照已发表的鸽新城疫毒株Pi/SH/CH/0168/2013（KT163263.1）全基因序列，利用Premier5.0软件设计扩增HN基因的引物F3/F4。HN基因目的产物大小为2186bp，引物由金唯智生物科技有限公司合成，设计的引物序列如下：
F3：5 TGACAACCTGTTCAATGG3
F4：5 ATAGATGTGACTCTGGTAGGAT3
1．2．1．2 病毒RNA的提取
将发病鸽脑组织做匀浆处理，按TaKaRa Mini BEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 5.0(TaKaRa)试剂盒说明书上的操作步骤进行病毒RNA的提取。
1．2．1．3 反转录聚合酶链式反应（RTPCR）检测
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