华东地区猪流行性腹泻病毒分子流行病学调查
猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea, PED)是一种以猪群急性水样腹泻、呕吐以及脱水为主要特征的高度接触性传染的肠道疾病。自2010年以来，该病给我国的养猪业造成了重大的经济损失。为了解华东地区PED的流行现状，本研究收集了自2015年1月至5月华东地区15个规模猪场的91份腹泻病料样品，采用RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒（PEDV)，并用该法扩增了17个具有代表性的PEDV阳性样品的ORF3和N基因序列，测序后进行序列和遗传进化分析。结果显示，有42份样品为PEDV阳性，病料阳性率46.15 %，表明 PEDV 可能是当前导致猪腹泻的一种主要病原；序列分析显示，17个样品的ORF3序列同源性在98.7%~100%之间，N序列同源性在95.9%~100%之间，与经典毒株相比，这些毒株的ORF3和N中均存在多处变异；遗传进化分析发现，检测分离的17个PEDV阳性样品毒株与经典毒株CV777的遗传进化距离较远。以上结果表明我国华东江苏省及周边地区的流行毒株为变异株，积极开展针对PEDV变异株的防控工作对本地区养猪业的发展意义重大。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言1
1材料与方法2
1.1材料2
1.1.1病料样品2
1.1.2主要试剂2
1.1.3主要仪器设备2
1.1.4引物2
1.2方法2
1.2.1样品处理方法2
1.2.2 RNA提取 3
1.2.3RTPCR扩增3
1.2.4 PCR产物鉴定3
1.2.5纯化回收3
1.2.6 PCR产物连接3
1.2.7转化3
1.2.8序列测定4
1.2.9序列确定、分析和比较4
1.2.10参考序列 4
2结果与分析4
2.1临床样品检测4
2.2目的基因的扩增5
2.3 ORF3基因序列分析 5
2.3.1同源性分析5
2.3.2序列比对分析6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
/> 2.3.3遗传进化分析8
2.4 N基因序列分析9
2.4.1同源性分析9
2.4.2序列比对分析10
2.4.3遗传进化分析13
3讨论14
致谢 15
参考文献 15
华东地区猪流行性腹泻病毒的分子流行病学调查
引言
猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea, PED)是一种以猪群急性水样腹泻、呕吐以及脱水为主要特征的高度接触性传染性的肠道疾病。该病流行的季节性不明显，但在季节变换以及气温降低时的发病率较高。临床症状的轻重与猪日龄大小有关，20日龄以内的仔猪死亡率超过95%；成年猪会出现呕吐、厌食及精神沉郁等症状[1]。猪流行性腹泻病变的发生部位主要在仔猪小肠，表现为肠内充满黄色水样液体，肠壁变薄呈半透明状，肠淋巴结充血、水肿等[2]。
猪流行性腹泻的病原是猪流行性腹泻病毒( Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)。PEDV主要在小肠绒毛上皮细胞中复制，属于尼多病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属。PEDV的基因组为单股正链RNA，其5’端非翻译区包含一个帽子结构(cap)，3’非翻译区包含1个Poly ( A)尾，其构成从5’端到3’端依次为5UTR Replicase (ORF1 a and ORF1 b)SORF3EMN3UTR。Replicase基因编码复制酶多聚蛋白(replicases 1a 和 1b，PP1ab)，ORF3基因编码PEDV的非结构蛋白，S基因、E基因、M基因和N基因分别编码病毒的结构蛋白——纤突蛋白、小包蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白，其中基因组与核衣壳蛋白结合，基因组不分节段[3]。
猪流行性腹泻自1971年首次在英国暴发以来，相继在比利时、德国等许多欧洲国家发生过暴发流行，20世纪80年代，日本、韩国、中国等一些亚洲国家也暴发了该病[4]。随着我国养猪业的规模化、集约化发展，猪病毒性腹泻病的流行与暴发日益增多，尤其是2010年以来，该病在国内多个地区广泛传播，在GenBank中收录的PEDV序列，涵盖了中国包括华北、华南、华东、西北和东北区域的多个省份[5]。至2014年，PEDV检测的阳性省份已经覆盖了我国所有养猪的主要产区，成为近年来猪群腹泻疫情的主要病原[6]。本研究对从华东地区15个猪场采集的91份样品进行了阳性检测，并对阳性样品进行了测序和序列分析，从而完成本次的猪流行性腹泻的分子流行病学调查。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 病料样品 2015年1月至2015年5月主要采集于我国华东地区的15个腹泻发病猪场的91份样品，病料样品为不同日龄发病猪的肠道或粪便，采集后于20℃保存。
1．1．2 主要试剂 病毒 RNA 提取 TRIzol 试剂、RNA 酶抑制剂 （RNasin）、TransGen Biotech的Onestep RTPCR SuperMix试剂盒、DNA Marker (DL 2,000) 、pMD19T 载体购自宝生物工程（大连）有限公司；DEPC、LA Taq DNA Polymerase购自 Promega公司；Gel Extraction Kit购自 AXYGEN 公司、Trans5α感受态细胞购自全式金生物公司；其他试剂均为分析纯。
1．1．3 主要仪器设备 DYY6C 型电泳仪（北京六一仪器厂）、DK8D 型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）、海河恒温培养箱（天津试验仪器厂）、WH2涡旋混匀器（上海沪西分析仪器有限公司）、小型高速离心机（eppendorf 公司）、70低温冰箱（日本三洋公司）、DYCP31D 型水平电泳槽( 北京六一厂)、电泳凝胶成像系统（上海复日）、TaKaRa PCR Thermal Cycler DiceTM 梯度PCR仪（日本TaKaRa公司）。
1．1．4 引物 根据GenBank 中公布的 BJ20111、CV777及JSHZ2012等毒株的基因序列，设计扩增ORF3和N的引物（表1），所有引物由南京思普金（Sprigen）生物科技有限公司合成。
表1 扩增ORF3和N的引物
名称
核酸序列
扩增长度（bp）
PEDVORF3 F
5’ TCCTAGACTTCAACCTTACG 3’
780
PEDVORF3 R
5’ GGTGACAAGTGAAGCACAGA3’
780
PEDVN F
5’ TTTGGATCCATGGCTTCTGTCAGTTTTCAGGAT 3’
1300
PEDVN R
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言1
1材料与方法2
1.1材料2
1.1.1病料样品2
1.1.2主要试剂2
1.1.3主要仪器设备2
1.1.4引物2
1.2方法2
1.2.1样品处理方法2
1.2.2 RNA提取 3
1.2.3RTPCR扩增3
1.2.4 PCR产物鉴定3
1.2.5纯化回收3
1.2.6 PCR产物连接3
1.2.7转化3
1.2.8序列测定4
1.2.9序列确定、分析和比较4
1.2.10参考序列 4
2结果与分析4
2.1临床样品检测4
2.2目的基因的扩增5
2.3 ORF3基因序列分析 5
2.3.1同源性分析5
2.3.2序列比对分析6
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
/> 2.3.3遗传进化分析8
2.4 N基因序列分析9
2.4.1同源性分析9
2.4.2序列比对分析10
2.4.3遗传进化分析13
3讨论14
致谢 15
参考文献 15
华东地区猪流行性腹泻病毒的分子流行病学调查
引言
猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea, PED)是一种以猪群急性水样腹泻、呕吐以及脱水为主要特征的高度接触性传染性的肠道疾病。该病流行的季节性不明显，但在季节变换以及气温降低时的发病率较高。临床症状的轻重与猪日龄大小有关，20日龄以内的仔猪死亡率超过95%；成年猪会出现呕吐、厌食及精神沉郁等症状[1]。猪流行性腹泻病变的发生部位主要在仔猪小肠，表现为肠内充满黄色水样液体，肠壁变薄呈半透明状，肠淋巴结充血、水肿等[2]。
猪流行性腹泻的病原是猪流行性腹泻病毒( Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)。PEDV主要在小肠绒毛上皮细胞中复制，属于尼多病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属。PEDV的基因组为单股正链RNA，其5’端非翻译区包含一个帽子结构(cap)，3’非翻译区包含1个Poly ( A)尾，其构成从5’端到3’端依次为5UTR Replicase (ORF1 a and ORF1 b)SORF3EMN3UTR。Replicase基因编码复制酶多聚蛋白(replicases 1a 和 1b，PP1ab)，ORF3基因编码PEDV的非结构蛋白，S基因、E基因、M基因和N基因分别编码病毒的结构蛋白——纤突蛋白、小包蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白，其中基因组与核衣壳蛋白结合，基因组不分节段[3]。
猪流行性腹泻自1971年首次在英国暴发以来，相继在比利时、德国等许多欧洲国家发生过暴发流行，20世纪80年代，日本、韩国、中国等一些亚洲国家也暴发了该病[4]。随着我国养猪业的规模化、集约化发展，猪病毒性腹泻病的流行与暴发日益增多，尤其是2010年以来，该病在国内多个地区广泛传播，在GenBank中收录的PEDV序列，涵盖了中国包括华北、华南、华东、西北和东北区域的多个省份[5]。至2014年，PEDV检测的阳性省份已经覆盖了我国所有养猪的主要产区，成为近年来猪群腹泻疫情的主要病原[6]。本研究对从华东地区15个猪场采集的91份样品进行了阳性检测，并对阳性样品进行了测序和序列分析，从而完成本次的猪流行性腹泻的分子流行病学调查。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 病料样品 2015年1月至2015年5月主要采集于我国华东地区的15个腹泻发病猪场的91份样品，病料样品为不同日龄发病猪的肠道或粪便，采集后于20℃保存。
1．1．2 主要试剂 病毒 RNA 提取 TRIzol 试剂、RNA 酶抑制剂 （RNasin）、TransGen Biotech的Onestep RTPCR SuperMix试剂盒、DNA Marker (DL 2,000) 、pMD19T 载体购自宝生物工程（大连）有限公司；DEPC、LA Taq DNA Polymerase购自 Promega公司；Gel Extraction Kit购自 AXYGEN 公司、Trans5α感受态细胞购自全式金生物公司；其他试剂均为分析纯。
1．1．3 主要仪器设备 DYY6C 型电泳仪（北京六一仪器厂）、DK8D 型电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）、海河恒温培养箱（天津试验仪器厂）、WH2涡旋混匀器（上海沪西分析仪器有限公司）、小型高速离心机（eppendorf 公司）、70低温冰箱（日本三洋公司）、DYCP31D 型水平电泳槽( 北京六一厂)、电泳凝胶成像系统（上海复日）、TaKaRa PCR Thermal Cycler DiceTM 梯度PCR仪（日本TaKaRa公司）。
1．1．4 引物 根据GenBank 中公布的 BJ20111、CV777及JSHZ2012等毒株的基因序列，设计扩增ORF3和N的引物（表1），所有引物由南京思普金（Sprigen）生物科技有限公司合成。
表1 扩增ORF3和N的引物
名称
核酸序列
扩增长度（bp）
PEDVORF3 F
5’ TCCTAGACTTCAACCTTACG 3’
780
PEDVORF3 R
5’ GGTGACAAGTGAAGCACAGA3’
780
PEDVN F
5’ TTTGGATCCATGGCTTCTGTCAGTTTTCAGGAT 3’
1300
PEDVN R
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