猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的制备及活性检测
:猪肺炎支原体是造成猪支原体肺炎（MPS）的主要病原体，它引起猪呼吸道疾病并且是导致猪生长发育迟缓的主要原因。研究表明通过向肺内注射活疫苗是可以有效预防猪支原体肺炎的发生，但是这种注射方法在临床应用时有很多缺陷。本试验通过研究气溶胶疫苗，旨在克服猪支原体肺炎疫苗肺内注射的技术缺点，为猪群提供新的自动化的免疫平台。本试验通过超声雾化器制备并通过共聚焦显微镜观察到气溶胶颗粒；分别通过压力喷雾器和超声雾化器的雾化研究不同雾化器和稀释液对疫苗活力的影响。结果表明使用超声雾化器较使用压力喷雾器疫苗活力损失小；在稀释液中添加甘油可以对疫苗活力产生一定的保护作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的制备及观察3
1.2.1 猪支原体肺炎168株染色3
1.2.2喷雾样品制备3
1.2.3采样观察3
1.3 猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的活性检测3
1.3.1冻干疫苗的稀释3
1.3.2雾化前样品收集3
1.3.3设备连接及雾化 3
1.3.4雾化后样品收集3
1.3.5滴度测定—CCU50法3
1.3.6菌液DNA提取4
1.3.7荧光定量PCR试验4
1.3.8计算与分析4
2结果与分析4
2.1 猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的制备及观察试验结果4
2.2 猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的活性检测试验结果5
3讨论 6
致谢7
参考文献7
猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的制备与活性检测
引言
猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumona of swine, MPS）又名猪气喘病或者地方流行性肺炎（Swine enzootic pneumonia），是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp）引起的一种呼吸道传染病，以接触性、传染性、慢
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
性、高发病率和低病死率为特点[1]。本病遍布全球，发病率较高，并且易引起其它疾病的继发感染，比如猪圆环病毒2型、猪呼吸与繁殖综合征病毒和多杀性巴氏杆菌[2]，给养猪业造成巨大的经济损失，接种疫苗是防控该病的重要途径之一。目前，市场上主要使用的猪支原体肺炎疫苗为常规全菌体疫苗，包括灭活疫苗及弱毒活疫苗。灭活疫苗可以增加日增重并且降低肺的损伤，但是不能彻底清除猪肺炎支原体。血清中浓缩的IgG抗体和呼吸道分泌物不能够预防肺炎[3]。注射弱毒疫苗可以激活宿主的细胞和黏膜免疫从而达到保护宿主的作用，并且在呼吸道产生的sIgA特异性抗体和IFNγ因子和全身细胞免疫系统的水平可能确保免疫猪肺炎支原体病的可靠性[4]。然而，传统的针头注射方法，比如肌肉注射灭活疫苗和肺内注射弱毒疫苗既费力又费时，为疫苗的大面积推广带来困难。因此，有必要研发一种替换针头注射的方法，比如口服或喷雾方法。
气溶胶活疫苗免疫是一种既方便又有效的免疫接种方式，特别是针对呼吸道病原疫苗的免疫,更能起到直接而有效的作用。它提供了很多优势，包括应用的方便和快速，无针刺激导致更高的动物接受度，降低血源感染源交叉污染的风险，减少医疗废物，并有可能降低成本[5][6]，已广泛应用于家禽。尽管气溶胶疫苗有很多优势，但其免疫效果也受很多因素的影响，包括雾化前的因素（菌苗的种类、菌苗的性状、保存条件、生长条件等）、雾化过程中的因素（雾化器造成的剪切力）及雾化后因素（环境温湿度、光线、气体、稀释液等），这些因素都会对喷雾后气溶胶疫苗的活力产生影响[710]。
本研究中，我们分别使用压力喷雾器和超声雾化器雾化产生气溶胶疫苗，通过共聚焦显微镜观察气溶胶的基本形态以及猪肺炎支原体在单个气溶胶的分布，并通过CCU50方法检测雾化前后疫苗的活性。喷雾器的参数设置及环境因素（温度和相对湿度）都达到最佳。结果成功制备气溶胶疫苗并观察到支原体在其内的分布。CCU50法结果表明压力喷雾器较超声雾化器效果好，稀释液中添加甘油对疫苗活力有一定的保护作用。
1 材料与方法
1.1试验材料
1.1.1 冻干疫苗、菌种及菌种培养基 猪支原体肺炎冻干活疫苗（168株）由江苏省农业科学院兽医研究所猪病防控研究室提供。猪肺炎支原体168强弱毒株由江苏省农业科学院兽医研究所猪病防控研究室提供。菌株培养基（KM2）主要成分包括：水解乳蛋白、酵母、Eagles MEM、酚红等，由江苏省农科院兽医所猪病防控研究室配制。
1.1.2 主要材料与试剂 甘油购自上海源景化学品有限公司产品；96孔细胞板：美国CORNINGCOSTAR系列产品； CFDASE（细胞增殖示踪荧光探针）：购自碧云天生物技术研究所；二甲基亚砜，南京恒诺医药化工有限公司产品；钻石牌盖玻片（22×22mm；0.130.17mm THICK）；0.22μm滤器：Millipore 公司产品；其他常规试剂均为分析纯等级。
1.1.3 主要仪器 超声波雾化器（WH2000型），广东粤华医疗器械厂有限公司；直联便携式空气压缩机，购自温岭市飓霸机械有限公司；Pari LCD喷雾器，德国Starnberg产品； BioSampler玻璃生物采样器，美国SKC公司；雾化空气模型箱（60.3cm*60.3cm*120.5cm，V=438.1L），自制；ABI7500实时荧光定量PCR仪，美国Life Technologies公司产品；真空泵，金坛市康华电子仪器制造厂；LDZM型立式智能压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；DNP9052型电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；德国Sigma3K15高速冷冻离心机，购自北京五洲东方科技发展有限公司；HYQ2121A型涡旋混匀器，苏州捷美电子有限公司。
1.1.4 主要试剂的配制
（1）0.9%NaCl溶液
NaCl 0.9g
加超纯水定容至100mL，用NaOH溶液调至pH7.2，高压灭菌后，室温保存。
（2）1%NaOH溶液
NaOH 1g
加超纯水定容至100mL，高压灭菌后，室温保存。
（3）PBS溶液
NaCl 8g
KCl 0.2g
Na2HPO4 3.65g
KH2PO4 0.24g
加超纯水定容至1000mL，用NaOH溶液调至pH 7.2，高压灭菌后，室温保存。
（4）含5%甘油的PBS溶液
甘油 5mL
加PBS溶液定容至100mL，使用NaOH溶液调至pH7.2，高压灭菌后，室温保存。
1.2 猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的制备及观察
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的制备及观察3
1.2.1 猪支原体肺炎168株染色3
1.2.2喷雾样品制备3
1.2.3采样观察3
1.3 猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的活性检测3
1.3.1冻干疫苗的稀释3
1.3.2雾化前样品收集3
1.3.3设备连接及雾化 3
1.3.4雾化后样品收集3
1.3.5滴度测定—CCU50法3
1.3.6菌液DNA提取4
1.3.7荧光定量PCR试验4
1.3.8计算与分析4
2结果与分析4
2.1 猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的制备及观察试验结果4
2.2 猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的活性检测试验结果5
3讨论 6
致谢7
参考文献7
猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的制备与活性检测
引言
猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumona of swine, MPS）又名猪气喘病或者地方流行性肺炎（Swine enzootic pneumonia），是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp）引起的一种呼吸道传染病，以接触性、传染性、慢
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
性、高发病率和低病死率为特点[1]。本病遍布全球，发病率较高，并且易引起其它疾病的继发感染，比如猪圆环病毒2型、猪呼吸与繁殖综合征病毒和多杀性巴氏杆菌[2]，给养猪业造成巨大的经济损失，接种疫苗是防控该病的重要途径之一。目前，市场上主要使用的猪支原体肺炎疫苗为常规全菌体疫苗，包括灭活疫苗及弱毒活疫苗。灭活疫苗可以增加日增重并且降低肺的损伤，但是不能彻底清除猪肺炎支原体。血清中浓缩的IgG抗体和呼吸道分泌物不能够预防肺炎[3]。注射弱毒疫苗可以激活宿主的细胞和黏膜免疫从而达到保护宿主的作用，并且在呼吸道产生的sIgA特异性抗体和IFNγ因子和全身细胞免疫系统的水平可能确保免疫猪肺炎支原体病的可靠性[4]。然而，传统的针头注射方法，比如肌肉注射灭活疫苗和肺内注射弱毒疫苗既费力又费时，为疫苗的大面积推广带来困难。因此，有必要研发一种替换针头注射的方法，比如口服或喷雾方法。
气溶胶活疫苗免疫是一种既方便又有效的免疫接种方式，特别是针对呼吸道病原疫苗的免疫,更能起到直接而有效的作用。它提供了很多优势，包括应用的方便和快速，无针刺激导致更高的动物接受度，降低血源感染源交叉污染的风险，减少医疗废物，并有可能降低成本[5][6]，已广泛应用于家禽。尽管气溶胶疫苗有很多优势，但其免疫效果也受很多因素的影响，包括雾化前的因素（菌苗的种类、菌苗的性状、保存条件、生长条件等）、雾化过程中的因素（雾化器造成的剪切力）及雾化后因素（环境温湿度、光线、气体、稀释液等），这些因素都会对喷雾后气溶胶疫苗的活力产生影响[710]。
本研究中，我们分别使用压力喷雾器和超声雾化器雾化产生气溶胶疫苗，通过共聚焦显微镜观察气溶胶的基本形态以及猪肺炎支原体在单个气溶胶的分布，并通过CCU50方法检测雾化前后疫苗的活性。喷雾器的参数设置及环境因素（温度和相对湿度）都达到最佳。结果成功制备气溶胶疫苗并观察到支原体在其内的分布。CCU50法结果表明压力喷雾器较超声雾化器效果好，稀释液中添加甘油对疫苗活力有一定的保护作用。
1 材料与方法
1.1试验材料
1.1.1 冻干疫苗、菌种及菌种培养基 猪支原体肺炎冻干活疫苗（168株）由江苏省农业科学院兽医研究所猪病防控研究室提供。猪肺炎支原体168强弱毒株由江苏省农业科学院兽医研究所猪病防控研究室提供。菌株培养基（KM2）主要成分包括：水解乳蛋白、酵母、Eagles MEM、酚红等，由江苏省农科院兽医所猪病防控研究室配制。
1.1.2 主要材料与试剂 甘油购自上海源景化学品有限公司产品；96孔细胞板：美国CORNINGCOSTAR系列产品； CFDASE（细胞增殖示踪荧光探针）：购自碧云天生物技术研究所；二甲基亚砜，南京恒诺医药化工有限公司产品；钻石牌盖玻片（22×22mm；0.130.17mm THICK）；0.22μm滤器：Millipore 公司产品；其他常规试剂均为分析纯等级。
1.1.3 主要仪器 超声波雾化器（WH2000型），广东粤华医疗器械厂有限公司；直联便携式空气压缩机，购自温岭市飓霸机械有限公司；Pari LCD喷雾器，德国Starnberg产品； BioSampler玻璃生物采样器，美国SKC公司；雾化空气模型箱（60.3cm*60.3cm*120.5cm，V=438.1L），自制；ABI7500实时荧光定量PCR仪，美国Life Technologies公司产品；真空泵，金坛市康华电子仪器制造厂；LDZM型立式智能压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；DNP9052型电热恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；德国Sigma3K15高速冷冻离心机，购自北京五洲东方科技发展有限公司；HYQ2121A型涡旋混匀器，苏州捷美电子有限公司。
1.1.4 主要试剂的配制
（1）0.9%NaCl溶液
NaCl 0.9g
加超纯水定容至100mL，用NaOH溶液调至pH7.2，高压灭菌后，室温保存。
（2）1%NaOH溶液
NaOH 1g
加超纯水定容至100mL，高压灭菌后，室温保存。
（3）PBS溶液
NaCl 8g
KCl 0.2g
Na2HPO4 3.65g
KH2PO4 0.24g
加超纯水定容至1000mL，用NaOH溶液调至pH 7.2，高压灭菌后，室温保存。
（4）含5%甘油的PBS溶液
甘油 5mL
加PBS溶液定容至100mL，使用NaOH溶液调至pH7.2，高压灭菌后，室温保存。
1.2 猪支原体肺炎气溶胶活疫苗的制备及观察
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