快速检测志贺毒素2基因的荧光定量pcr方法的建立

本研究旨在建立检测所有志贺毒素（Shiga toxin 2, stx2）亚型的二重定量PCR(real-time PCR, RT-PCR)方法。根据GenBank已登陆stx2基因A亚基序列，选定保守区域设计上下游引物和探针，构建重组质粒作为阳性模板，优化反应条件，分别建立单重stx2f-RT-PCR、单重stx2ae-RT-PCR和二重stx2f/stx2ae-RT-PCR，并检测临床样品。结果显示以pMD19-T-stx2f重组质粒标准品建立的标准曲线在3copies/μL~3×107copies/μL具有良好的线性关系，相关系数为0.99，扩增效率118.56，最低检出量为3copies/μL；以pMD19-T-stx2ae重组质粒标准品建立的标准曲线在7copies/μL~7×107copies/μL具有良好的线性关系，相关系数为0.995，扩增效率112.424，最低检出量为7copies/μL；以pMD19-T-stx2f和pMD19-T-stx2ae重组质粒混合物建立的标准曲线在9copies/μL~9×107copies/μL具有良好的线性关系，相关系数为0.998，最低检出量为9 copies/μL，扩增效率115.51。36份临床样品中，stx2f阳性率为0%，与PCR检测结果一致；stx2ae阳性率为13.9%（5/36），与PCR检测率一致。本研究建立的荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好，可为产志贺毒素大肠杆菌的流行病学调查和相关亚单位疫苗的研究提供有效工具。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 2
引言2
1 材料与方法 3
1.1 材料3
1.2 菌株3
1.3 方法4
1.3.1 引物及探针的设计4
1.3.2 模板的制备5
1.3.3 质粒标准品的制备5
1.3.4 定量PCR的建立6
1.3.5 单重标准曲线的建立7
1.3.6 单重标准曲线的建立7
1.3.7 重复性试验 8
1.3.8 临床样品检测试验8
2 结果与分析8
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2.1 普通PCR扩增结果8
2.2、2.3 重组质粒制备 9
2.4定量PCR条件的优化11
2.5、2.6单重定量PCR标准曲线的建立 13
2.7 双重定量PCR标准曲线的建立 13
2.8 灵敏度比较试验 14
2.9 重复性试验 14
2.10 临床样品检测15
3 讨论 16
致谢 17
参考文献 17
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