禽致病性大肠杆菌ompt和ompf的原核表达及多克隆抗体的制备
1大肠杆菌ompT( Outer-membrane protein T) 是革兰氏阴性细菌分泌到细胞表面具有丝氨酸蛋白酶活性的一种重要蛋白。ompF( Outer-membrane protein F)形成的离子通道是大肠杆菌与外界进行物质交换的重要通道。利用ompT和ompF在大肠杆菌中具有高度的保守性和同源性，又是大肠杆菌表面重要的抗原表位，可以为进一步试验研究和临床诊断大肠杆菌病和研制亚单位疫苗提供实验依据。根据大肠杆菌外膜蛋白ompT和ompF的基因序列设计两对引物，应用PCR方法，从大肠杆菌基因组中扩增获得分别为816bp和984bp的序列。经BamH I和Xol I双酶切后，将其序列定向克隆到原核表达载体pET28a上构建重组表达质粒pET28a-ompT和pET28a-ompF。经IPTG诱导后，在表达宿主菌中特异性的表达出分子量约为36kDa和39kDa的ompT和ompF蛋白，纯化后免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体并经western-blot验证得到高免血清。
目录
引言
ompT( Outermembrane protein T)和ompF( Outermembrane protein F)都是大肠杆菌最重要的外膜蛋白。ompT可以降解抗菌肽[1]，ompT 具有特异性切割肽链某些位点的能力，可以将某类蛋白( 或多肽) 切割成多个肽段使得这类蛋白( 或多肽) 失活或者被降解成一种新的具有一定生物活性的多肽[2,3,4]。ompF形成的离子通道是大肠杆菌与外界进行物质交换的重要通道[5]，允许不超过600 Da 的小分子水溶性物质通过细胞膜，也是抗生素进入细胞的主要通道[6]。
大肠杆菌血清型众多，地域性强，感染性高，耐药性突出，严重影响养殖业的发展。而使用抗生素防治大肠杆菌易产生耐药性，同时药物残留又影响猪肉及其他畜禽产品的质量，严重威胁人类健康[7]。
ompT和ompF在大肠杆菌中具有高度的保守性和同源性[6,8]，而且是大肠杆菌表面重要的抗原表位[9,10]，因此，本实验旨在制备、纯化ompT和ompF蛋白的多克隆抗体，为进一步试验研究和临床诊断大肠杆菌病和研制亚单位疫苗提供实验依据。
1 材料与方法
材料
酶、载体、引物、和主要 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
试剂 2×Taq Master Mix、DNA Marker、限制性内切酶BamH I和XhoⅠ、Ligation Mix均购自TaKaRa公司；异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购自Genview公司；30%丙烯酰胺、1.5M三羟甲氨基甲烷（Tris）缓冲液、10%十二烷基硫酸钠（SDS）、10%过硫酸铵（AP）、TEMED均购自南京鼎思生物科技有限公司；Plasmid Mini KitⅠ（200）质粒小量快速提取试剂盒、Gel Extraction Kit（200）琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒、DNA提取试剂盒均购自OMEGA公司；丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、冰乙酸和甲醇等均为国产分析纯试剂；表达载体pET28a和为实验室保存；引物合成和核苷酸测序由上海桑尼生物工程公司完成。
菌株和实验动物 实验菌株禽致病性大肠杆菌（(Avian pathogenic E.coli，
APEC）TWXM (O2:K1)由微生物实验室保存，实验动物新西兰大白兔由江苏省农业科学院种兔场提供。
培养基 本实验所用的培养基为LB培养基：其液体成分为Nacl 10 g/L，蛋白胨（tryptone）10 g/L，酵母提取物（yeast） 5 g/L，pH 7.0。其中加入1.5%琼脂粉即为LB固体培养基。
方法
蛋白选择与引物设计 在NCBI上找到禽致病性大肠杆菌APEC O1全基因组序列，选取其中编码ompT和ompF蛋白的相应基因序列，利用primer premier5.0引物设计软件设计引物，表达用引物需加酶切位点和除去信号肽部分，由上海桑尼公司合成部合成。
上游引物（5’3’） ompFF: CGCGGATCCGATCTGTACGGTAAAGCTGTCG
ompTF: CGCGGATCCAACATAAATGCGGACATTAGTC(下划线处为BamH I酶切位点)；
下游引物（5’3’） ompFR: CCGCTCGAGCTGGTAAACGATACCCACAGCA
ompTR: CCGCTCGAGTATGCCTGCACCATTTTTGCTG（(下划线处为XhoⅠ酶切位点)。
大肠杆菌基因组总DNA的提取
提取方法：
细菌在LB 液体中培养过夜；
收集23 mlLB培养物，4000 g室温离心10 min弃上清；
用180μl TE buffer重悬，加入20 μl 50 mg/ml的lysozyme液体30℃孵育10 min；5000 g室温离心5 min，沉淀消化的细胞，弃上清，加入200 μl buffer BTL涡旋重悬细胞；
加入25 μl proteinase K solution，涡旋混匀，55℃摇动水浴孵育至细菌完全裂解一般不超过1小时；
加入5 μl RNase A ，离心管颠倒混匀数次，室温孵育1030 min；加入220 μl buffer BDL，摇晃或简单涡旋混匀；
65℃孵育10 min；加入无水乙醇220 μl，彻底涡旋20 s如果还能看到沉淀，用移液器吹打吹散；
将HiBind DNA mini column 装入到2 ml收集管中，将全部样品加入到柱子中，12000 g离心1 min，使DNA结合到柱子上去，丢弃收集管和滤液；
将柱子装入另一收集管，用500 μl buffer HB 冲洗，12000 g离心1 min，倒掉收集管中的液体，收集管重新使用；
用700 μl DNA Wash buffer冲洗，12000 g离心1 min，倒掉收集管中的液体；
空柱子13000 g离心2 min，使柱子完全干燥；
将柱子装入1.5 ml离心管中，加入30 μl的65℃预热去离子水，65℃孵育35 min；10000 g离心1 min，洗脱DNA，可再洗脱一次，以提高洗脱率；
测定DNA浓度， 20℃保存备用。
目的基因的获取 对表达蛋白的目的基因进行PCR扩增。用APECTWXM的基因组为模板以ompF和ompT的引物扩增目的片段。
反应体系（25 μl）如下：
上下游引物各1 μl，2×Taq PFU Master Mix 12.5 μl，ddH2O 9 μl，模板1.5 μl。反应条件为：95℃ 5 min；94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min 30 s，30个循环；72℃延伸10 min；16℃保存。
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引言
ompT( Outermembrane protein T)和ompF( Outermembrane protein F)都是大肠杆菌最重要的外膜蛋白。ompT可以降解抗菌肽[1]，ompT 具有特异性切割肽链某些位点的能力，可以将某类蛋白( 或多肽) 切割成多个肽段使得这类蛋白( 或多肽) 失活或者被降解成一种新的具有一定生物活性的多肽[2,3,4]。ompF形成的离子通道是大肠杆菌与外界进行物质交换的重要通道[5]，允许不超过600 Da 的小分子水溶性物质通过细胞膜，也是抗生素进入细胞的主要通道[6]。
大肠杆菌血清型众多，地域性强，感染性高，耐药性突出，严重影响养殖业的发展。而使用抗生素防治大肠杆菌易产生耐药性，同时药物残留又影响猪肉及其他畜禽产品的质量，严重威胁人类健康[7]。
ompT和ompF在大肠杆菌中具有高度的保守性和同源性[6,8]，而且是大肠杆菌表面重要的抗原表位[9,10]，因此，本实验旨在制备、纯化ompT和ompF蛋白的多克隆抗体，为进一步试验研究和临床诊断大肠杆菌病和研制亚单位疫苗提供实验依据。
1 材料与方法
材料
酶、载体、引物、和主要 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
试剂 2×Taq Master Mix、DNA Marker、限制性内切酶BamH I和XhoⅠ、Ligation Mix均购自TaKaRa公司；异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)购自Genview公司；30%丙烯酰胺、1.5M三羟甲氨基甲烷（Tris）缓冲液、10%十二烷基硫酸钠（SDS）、10%过硫酸铵（AP）、TEMED均购自南京鼎思生物科技有限公司；Plasmid Mini KitⅠ（200）质粒小量快速提取试剂盒、Gel Extraction Kit（200）琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒、DNA提取试剂盒均购自OMEGA公司；丙烯酰胺、过硫酸铵、甘氨酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、冰乙酸和甲醇等均为国产分析纯试剂；表达载体pET28a和为实验室保存；引物合成和核苷酸测序由上海桑尼生物工程公司完成。
菌株和实验动物 实验菌株禽致病性大肠杆菌（(Avian pathogenic E.coli，
APEC）TWXM (O2:K1)由微生物实验室保存，实验动物新西兰大白兔由江苏省农业科学院种兔场提供。
培养基 本实验所用的培养基为LB培养基：其液体成分为Nacl 10 g/L，蛋白胨（tryptone）10 g/L，酵母提取物（yeast） 5 g/L，pH 7.0。其中加入1.5%琼脂粉即为LB固体培养基。
方法
蛋白选择与引物设计 在NCBI上找到禽致病性大肠杆菌APEC O1全基因组序列，选取其中编码ompT和ompF蛋白的相应基因序列，利用primer premier5.0引物设计软件设计引物，表达用引物需加酶切位点和除去信号肽部分，由上海桑尼公司合成部合成。
上游引物（5’3’） ompFF: CGCGGATCCGATCTGTACGGTAAAGCTGTCG
ompTF: CGCGGATCCAACATAAATGCGGACATTAGTC(下划线处为BamH I酶切位点)；
下游引物（5’3’） ompFR: CCGCTCGAGCTGGTAAACGATACCCACAGCA
ompTR: CCGCTCGAGTATGCCTGCACCATTTTTGCTG（(下划线处为XhoⅠ酶切位点)。
大肠杆菌基因组总DNA的提取
提取方法：
细菌在LB 液体中培养过夜；
收集23 mlLB培养物，4000 g室温离心10 min弃上清；
用180μl TE buffer重悬，加入20 μl 50 mg/ml的lysozyme液体30℃孵育10 min；5000 g室温离心5 min，沉淀消化的细胞，弃上清，加入200 μl buffer BTL涡旋重悬细胞；
加入25 μl proteinase K solution，涡旋混匀，55℃摇动水浴孵育至细菌完全裂解一般不超过1小时；
加入5 μl RNase A ，离心管颠倒混匀数次，室温孵育1030 min；加入220 μl buffer BDL，摇晃或简单涡旋混匀；
65℃孵育10 min；加入无水乙醇220 μl，彻底涡旋20 s如果还能看到沉淀，用移液器吹打吹散；
将HiBind DNA mini column 装入到2 ml收集管中，将全部样品加入到柱子中，12000 g离心1 min，使DNA结合到柱子上去，丢弃收集管和滤液；
将柱子装入另一收集管，用500 μl buffer HB 冲洗，12000 g离心1 min，倒掉收集管中的液体，收集管重新使用；
用700 μl DNA Wash buffer冲洗，12000 g离心1 min，倒掉收集管中的液体；
空柱子13000 g离心2 min，使柱子完全干燥；
将柱子装入1.5 ml离心管中，加入30 μl的65℃预热去离子水，65℃孵育35 min；10000 g离心1 min，洗脱DNA，可再洗脱一次，以提高洗脱率；
测定DNA浓度， 20℃保存备用。
目的基因的获取 对表达蛋白的目的基因进行PCR扩增。用APECTWXM的基因组为模板以ompF和ompT的引物扩增目的片段。
反应体系（25 μl）如下：
上下游引物各1 μl，2×Taq PFU Master Mix 12.5 μl，ddH2O 9 μl，模板1.5 μl。反应条件为：95℃ 5 min；94℃30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min 30 s，30个循环；72℃延伸10 min；16℃保存。
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