猪nr5a2基因多态性与产仔数性状关联分析
NR5A2是一种重要的核受体，在体细胞重编程、胚胎发育、类固醇激素生成、生殖以及癌症发生等过程中都起着非常重要的作用，同时是雌性动物繁殖力的关键调节因子。本试验采用PCR扩增技术获得苏淮猪NR5A2基因编码区序列，利用生物信息学方法分析其序列特征，并分析编码区SNP多态性与产仔数性状的关系。结果发现苏淮猪NR5A2基因编码区序列全长为1332bp，编码蛋白含有444个氨基酸残基。在苏淮猪NR5A2基因编码区发现了T1191C的单碱基突变，但是该突变并没有引起氨基酸的改变。关联分析发现NR5A2基因T1191C位点多态性与苏淮猪产仔数无显著关联。研究结果表明，苏淮猪NR5A2基因编码区T1191C位点与苏淮猪产仔数无关。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 1
1材料与方法2
1.1实验动物 2
1.2主要仪器2
1.3溶液的配置2
1.4 提取基因组DNA3
1.5 PCR反应与测序3
1.6序列分析3
1.7 SNP位点多态性检测与鉴定 3
1.8 遗传参数的计算3
1.9 基因多态性与产仔数的关联分析4
2结果与分析4
2.1苏淮猪NR5A2基因PCR扩增结果4
2.2苏淮猪NR5A2基因核苷酸序列分析4
2.3苏淮猪NR5A2基因多态性位点筛选 5
2.4苏淮猪NR5A2基因编码区T1191C位点多态性筛选 6
2.5 苏淮猪NR5A2基因T1191C位点多态性与产仔数的关联系分析7
3讨论7
致谢8
参考文献8
图1 苏淮猪NR5A2基因扩增产物电泳图谱 4
图2苏淮猪NR5A2基因核苷酸序列与测序的氨基酸序列 5
图3苏淮猪NR5A2基因核苷酸序列与人、鼠、牛同源性对比5
图4 苏淮猪NR5A2基因编码区nt1191多态位点 6
图5 鉴定苏淮猪NR5A2基因nt1191位点的不同基因型 6
表1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
PCR引物及反应条件3
表2 苏淮猪NR5A2基因T1191C位点基因型频率、等位基因频率表 6
表3 苏淮猪NR5A2基因T1191C位点遗传多态性指标 6
表 4 生产性能关联分析表 7
苏淮猪NR5A2基因多态性与产仔数性状关联分析
引言
母猪的产仔数是一个重要的经济性状，随着产仔数的提高，肉猪的产量将极大的提高，这可以给养猪业带来巨大的经济效益。因此，商品猪育种的主要目标之一就是有效提高母猪的产仔数。但是产仔数性状是一个数量性状，遗传力比较低（0.1左右），并且这一性状只有在母猪产仔后才能度量，因此通过传统的育种方法对产仔数性状进行改良的效果并不是很理想。随着现代分子生物学和分子遗传学的发展，寻找高繁殖力基因的遗传标记以及通过遗传标记来提高猪的繁殖性能已经成为育种工作的首要任务[1]。
NR5A2（nuclear receptor subfamily 5，group A，member 2）是一种属于NR5A亚家族中重要的核受体，研究表明NR5A2基因是雌性动物繁殖力的关键调控因子，在调控哺乳动物卵泡发育、成熟和排卵等方面具有重要作用[35]，因此，NR5A2基因被认为是影响猪高繁殖力性状的候选基因。对于NR5A2的研究最早始于果蝇，并被鉴定为核受体FtzFl亚家族基因成员，随后在小鼠的肝脏组织中被提取出来，后来陆续发现在斑马鱼、大鼠、鸡、马、青蛙和人体内均有NR5A2基因。在成年哺乳动物中，NR5A2主要在肝、肠和卵巢等组织中表达[67]，特别是在卵巢组织中特异性表达[3,8,9]。进一步研究发现，在卵巢组织中NR5A2在卵子的发生、黄体的形成过程中得到高表达，而在黄体形成后NR5A2的表达量明显减少，表明NR5A2在卵巢颗粒细胞和黄体细胞中发挥重要作用[7,10]。牛卵巢优势卵泡和排卵前卵泡颗粒细胞中NR5A2基因的表达水平极显著高于小卵泡、黄体细胞，暗示了卵巢颗粒细胞中的NR5A2在哺乳动物卵泡发育和优势化过程中起到了关键的作用[4]。除此之外，研究结果还表明，在卵巢颗粒细胞中NR5A2是调节卵巢类固醇生成相关基因的表达以及雌激素合成的关键因子[3,11]。
Duggavathi等人在小鼠颗粒细胞内特异性敲除NR5A2基因导致了卵巢雌激素含量降低，黄体化增加，从而导致排卵数降低，降低了产仔数[5] 。同时还检测到，NR5A2基因特异性地敲除会导致雌性小鼠不孕，卵泡显著小于正常小鼠的卵泡，分析发现这种现象的产生是由于卵泡孕酮合成受阻以及排卵受到抑制。而在小鼠体内敲除NR5A2基因可以直接导致胚胎的死亡[1213]。近年来，NR5A2与家畜繁殖性能之间关系的研究开始逐渐受到关注。赵永祥[9]研究发现猪卵泡中NR5A2基因表达水平与卵泡液中雌激素（E2）含量呈极显著正相关，而敲减猪卵泡颗粒细胞中NR5A2基因后，雌激素合成通路中关键酶P450scc表达水平极显著下调。同时还发现高繁殖力猪种卵巢组织中NR5A2基因mRNA表达水平极显著高于低繁殖力猪种（P<0.01），RNA干扰发现NR5A2基因可促进卵泡颗粒细胞的增殖，抑制颗粒细胞凋亡，可见NR5A2基因与猪的繁殖力之间存在着密切的联系，是影响猪高繁殖力性状形成的候选基因。但目前关于猪NR5A2基因多态性方面的研究工作还未见报道。
苏淮猪（新淮猪瘦肉型母本新品系）是以抗逆性强、产仔数高的新淮猪为杂交母本，生长速度快、瘦肉率高的大约克夏猪种为杂交父本，于1998年开始培育的新型猪种[2]，目前关于苏淮猪的研究相对较少。本试验采用苏淮猪为研究对象，扩增苏淮猪NR5A2基因编码区序列，利用混合模板测序筛选SNP位点，检测苏淮猪NR5A2基因多态性， 并对SNP位点多态性与苏淮猪产仔数进行关联分析，为了解苏淮猪种质特征的分子遗传基础和苏淮猪的育种提供依据。
材料与方法
1.1 实验动物
苏淮猪74头，记录总产仔数指标，用耳号钳采集耳组织样约0.15g，置于装有75%酒精的离心管中，用冰盒带回实验室，用于提取基因组DNA。
1.2 主要仪器
可调式微量移液器：Eppendorf公司
超低温冰箱：Thereto公司
梯度PCR仪：TaKaRa公司
高速冷冻离心机：Eppendorf公司
DYYIII2电泳仪：北京流体仪器厂
电泳凝胶成像仪：BioRad公司
微波炉：格兰仕
1.3 溶液的配制
1.3.1电泳液配制
0.1%DEPC水的配制：1ml焦碳酸二乙酯（DEPC）溶于999ml双蒸水中，搅拌混匀，37℃静置过夜，高压灭菌，常温保存备用。
75%乙醇溶液：DEPC水125ml加入375ml纯乙醇中，共500ml备用。
1.3.2电泳试剂的配制
10×TBE浓储液：108Tris，55g硼酸，7.44gNa2EDTAH2O，溶于900ml去离子水中，定容至1L。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言 1
1材料与方法2
1.1实验动物 2
1.2主要仪器2
1.3溶液的配置2
1.4 提取基因组DNA3
1.5 PCR反应与测序3
1.6序列分析3
1.7 SNP位点多态性检测与鉴定 3
1.8 遗传参数的计算3
1.9 基因多态性与产仔数的关联分析4
2结果与分析4
2.1苏淮猪NR5A2基因PCR扩增结果4
2.2苏淮猪NR5A2基因核苷酸序列分析4
2.3苏淮猪NR5A2基因多态性位点筛选 5
2.4苏淮猪NR5A2基因编码区T1191C位点多态性筛选 6
2.5 苏淮猪NR5A2基因T1191C位点多态性与产仔数的关联系分析7
3讨论7
致谢8
参考文献8
图1 苏淮猪NR5A2基因扩增产物电泳图谱 4
图2苏淮猪NR5A2基因核苷酸序列与测序的氨基酸序列 5
图3苏淮猪NR5A2基因核苷酸序列与人、鼠、牛同源性对比5
图4 苏淮猪NR5A2基因编码区nt1191多态位点 6
图5 鉴定苏淮猪NR5A2基因nt1191位点的不同基因型 6
表1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
PCR引物及反应条件3
表2 苏淮猪NR5A2基因T1191C位点基因型频率、等位基因频率表 6
表3 苏淮猪NR5A2基因T1191C位点遗传多态性指标 6
表 4 生产性能关联分析表 7
苏淮猪NR5A2基因多态性与产仔数性状关联分析
引言
母猪的产仔数是一个重要的经济性状，随着产仔数的提高，肉猪的产量将极大的提高，这可以给养猪业带来巨大的经济效益。因此，商品猪育种的主要目标之一就是有效提高母猪的产仔数。但是产仔数性状是一个数量性状，遗传力比较低（0.1左右），并且这一性状只有在母猪产仔后才能度量，因此通过传统的育种方法对产仔数性状进行改良的效果并不是很理想。随着现代分子生物学和分子遗传学的发展，寻找高繁殖力基因的遗传标记以及通过遗传标记来提高猪的繁殖性能已经成为育种工作的首要任务[1]。
NR5A2（nuclear receptor subfamily 5，group A，member 2）是一种属于NR5A亚家族中重要的核受体，研究表明NR5A2基因是雌性动物繁殖力的关键调控因子，在调控哺乳动物卵泡发育、成熟和排卵等方面具有重要作用[35]，因此，NR5A2基因被认为是影响猪高繁殖力性状的候选基因。对于NR5A2的研究最早始于果蝇，并被鉴定为核受体FtzFl亚家族基因成员，随后在小鼠的肝脏组织中被提取出来，后来陆续发现在斑马鱼、大鼠、鸡、马、青蛙和人体内均有NR5A2基因。在成年哺乳动物中，NR5A2主要在肝、肠和卵巢等组织中表达[67]，特别是在卵巢组织中特异性表达[3,8,9]。进一步研究发现，在卵巢组织中NR5A2在卵子的发生、黄体的形成过程中得到高表达，而在黄体形成后NR5A2的表达量明显减少，表明NR5A2在卵巢颗粒细胞和黄体细胞中发挥重要作用[7,10]。牛卵巢优势卵泡和排卵前卵泡颗粒细胞中NR5A2基因的表达水平极显著高于小卵泡、黄体细胞，暗示了卵巢颗粒细胞中的NR5A2在哺乳动物卵泡发育和优势化过程中起到了关键的作用[4]。除此之外，研究结果还表明，在卵巢颗粒细胞中NR5A2是调节卵巢类固醇生成相关基因的表达以及雌激素合成的关键因子[3,11]。
Duggavathi等人在小鼠颗粒细胞内特异性敲除NR5A2基因导致了卵巢雌激素含量降低，黄体化增加，从而导致排卵数降低，降低了产仔数[5] 。同时还检测到，NR5A2基因特异性地敲除会导致雌性小鼠不孕，卵泡显著小于正常小鼠的卵泡，分析发现这种现象的产生是由于卵泡孕酮合成受阻以及排卵受到抑制。而在小鼠体内敲除NR5A2基因可以直接导致胚胎的死亡[1213]。近年来，NR5A2与家畜繁殖性能之间关系的研究开始逐渐受到关注。赵永祥[9]研究发现猪卵泡中NR5A2基因表达水平与卵泡液中雌激素（E2）含量呈极显著正相关，而敲减猪卵泡颗粒细胞中NR5A2基因后，雌激素合成通路中关键酶P450scc表达水平极显著下调。同时还发现高繁殖力猪种卵巢组织中NR5A2基因mRNA表达水平极显著高于低繁殖力猪种（P<0.01），RNA干扰发现NR5A2基因可促进卵泡颗粒细胞的增殖，抑制颗粒细胞凋亡，可见NR5A2基因与猪的繁殖力之间存在着密切的联系，是影响猪高繁殖力性状形成的候选基因。但目前关于猪NR5A2基因多态性方面的研究工作还未见报道。
苏淮猪（新淮猪瘦肉型母本新品系）是以抗逆性强、产仔数高的新淮猪为杂交母本，生长速度快、瘦肉率高的大约克夏猪种为杂交父本，于1998年开始培育的新型猪种[2]，目前关于苏淮猪的研究相对较少。本试验采用苏淮猪为研究对象，扩增苏淮猪NR5A2基因编码区序列，利用混合模板测序筛选SNP位点，检测苏淮猪NR5A2基因多态性， 并对SNP位点多态性与苏淮猪产仔数进行关联分析，为了解苏淮猪种质特征的分子遗传基础和苏淮猪的育种提供依据。
材料与方法
1.1 实验动物
苏淮猪74头，记录总产仔数指标，用耳号钳采集耳组织样约0.15g，置于装有75%酒精的离心管中，用冰盒带回实验室，用于提取基因组DNA。
1.2 主要仪器
可调式微量移液器：Eppendorf公司
超低温冰箱：Thereto公司
梯度PCR仪：TaKaRa公司
高速冷冻离心机：Eppendorf公司
DYYIII2电泳仪：北京流体仪器厂
电泳凝胶成像仪：BioRad公司
微波炉：格兰仕
1.3 溶液的配制
1.3.1电泳液配制
0.1%DEPC水的配制：1ml焦碳酸二乙酯（DEPC）溶于999ml双蒸水中，搅拌混匀，37℃静置过夜，高压灭菌，常温保存备用。
75%乙醇溶液：DEPC水125ml加入375ml纯乙醇中，共500ml备用。
1.3.2电泳试剂的配制
10×TBE浓储液：108Tris，55g硼酸，7.44gNa2EDTAH2O，溶于900ml去离子水中，定容至1L。
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