鸡h9亚型禽流感病毒的分离与鉴定
：禽流感是由禽流感病毒（Avian Influenza virus，AIV）引起的禽类烈性传染病，而H9亚型AIV是低致病性禽流感（Low Pathogenic Avian Influenza，LPAI)之一，在我国广泛分布，常引起禽类轻度的呼吸道感染，产蛋率下降等，当环境恶劣或与其它病原混合感染时，能引起严重的临床症状。1999年起，广东省疾控中心不断报道H9亚型禽流感感染人类的病例，因此H9亚型AIV不但给养禽业造成巨额损失，也威胁着人类的公共卫生安全。本实验通过对来自江苏省某养禽地的H9亚型AIV的可疑病料分离病毒、RNA提取和PCR基因扩增及基因测序，SPF鸡胚回归感染试验、鸡胚接种试验并提取尿囊液测序对比等初步证明病料含有H9亚型AIV，为病料来源地提供预防及治疗的意见及建议，并对H9亚型禽流感病毒的临床诊断和防治提供重要依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 病原2
1.1.2 SPF鸡胚2
1.1.3 动物2
1.1.4 扩增测序引物2
1.1.5 试剂2
1.1.6 主要仪器与耗材2
1.2 方法 2
1.2.1 病料处理2
1.2.2 病料的PCR诊断3
1.2.2.1 病毒RNA提取3
1.2.2.2 病毒RNA的反转录RT和PCR扩增3
1.2.2.3 电泳和核酸胶纯化及测序3
1.2.2.4 基因的序列拼接及BLAST3
1.2.3 病毒扩增4
1.2.4 易感动物回归试验4
1.2.5 血凝血凝抑制试验4
1.2.6 电泳和核酸胶纯化及测序4
2 结果与分析4
2.1 病鸡解剖结果4
2.2 病毒PCR扩增后电泳图5
2.3 基因序列拼接及BLAST结果6
2.4 易感动物回归试验7
2.5 血凝血凝抑制试验结果8
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
2.6 再测序及序列比对分析9
2.6.1 再测序及前后比对分析9
2.6.2 与亚洲各地病毒毒株序列比对分析10
3 讨论 10
致谢11
参考文献11
鸡H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定
引言
禽流感(Avian Influenza，AI)是由正黏病毒科（Orthomyxoviridae），A型流感病毒属中任一亚型引起的家禽、野鸟和部分哺乳动物发病的一种传染病[13]。根据其表面抗原性不同，鉴别为17 种HA 和10 种NA亚型[4]。其中H9亚型属于LPAI，自从1994年陈伯伦等从广东某地分离到H9亚型AIV以来，该病便在我国家禽中广泛流行[5]。由于该病具有感染率高、传播范围广、传播迅速等流行特点，尤其是与其他病原混合感染后会引起禽类死亡，并且确诊方法繁琐耗时长，给养禽业造成巨大经济耗损，也威胁着许多哺乳动物及人类的安全[67]。因此及时准确高效的诊断H9型AIV是有效防控的重要举措。本试验旨在初步分离鉴定来自江苏省某养禽地可疑病料，确定其感染H9亚型AIV，为禽养生产提供有效的诊断意见，便于及时治疗及免疫防控，以减少H9亚型AIV的发生所带来的经济损失。
材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 病原
病鸡来源：江苏省某地区养殖场，病鸡3只。
1. 1. 2 SPF鸡胚
9~11日龄SPF鸡胚，购自南京天邦生物科技有限公司。
1. 1. 3 动物
SPF非免疫鸡，购自南京天邦生物科技有限公司。
1. 1. 4 扩增测序引物
病毒鉴定用引物均由实验室制备、保存。H9亚型AIV基因扩增引物：上 游 5′ AGCGAAAGCGGGG3′ ;下 游 5′AGTAGAAACAAGGGTGTTTT3′。
HA 基 因 测 序 引 物 : R320 : 5′TAGGACCATTCTCTTCCTCC3′ ;
F186 :5′CACACAGAGCATAATGGGAT3′;
F580 : 5′CATTCTTTTCATGTGGGGCA3′ ;
F950 :5′TAAGTAAGTATGCATTTGGA3′;
F1350:5′CTGCTTGAAAACCAGAAAAC3′。
1. 1. 5 试剂
生理盐水自配，pH6.8～7.0； 1%鸡红细胞溶液，实验室配制，现配现用；反转录酶（MMLV）、RNase Out、10 mM dNTP、5×Buffer、10× PCR Buffer、2.5 mM dNTP、25 mM MgCl2、聚合酶（E×Taq）等，均购自TaKaRa公司；琼脂糖（BIOWEST AGAROSE G10），购自Gene Company LTD；RNA/DNA提取试剂盒和胶回收试剂盒，均购自康宁生命科学有限公司。
1. 1. 6 主要仪器与耗材
0.22μm微孔滤膜过滤器，Millipore lreland Ltd.产品；PCR仪，购自TaKaRa公司；电泳仪，购自南京普阳科学仪器研究所；全自动凝胶成像分析仪（JS680B），购自培清有限公司；高压锅（SY450），购自徐州圣业医疗器械有限责任公司。
其他材料和仪器：固体石蜡、打孔器、注射器、剪刀、镊子、离心机、研钵、超净工作台、70℃冰箱、20℃冰箱等。
1.2 方法
1.2.1 病料处理
主诉症状：该养禽地采用标准化鸡舍饲养，使用全价饲料兼自配料喂养，近期接连出现精神抑郁，产蛋率下降，蛋壳色泽变淡、变薄，少量眼角分泌物变多，面部肿胀，有轻度的呼吸啰音，饮食量下降，个别病禽出现腹泻下痢，严重的拒食，渴欲明显增强，嗉囊积液，鸡群出现营养不良、逐渐消瘦等症状。病初期，养殖人员认为是传染性鼻炎，磺胺类药物给药，效果并不明显。
病料用高压消毒后的手术剪分别解剖，无菌采集3份病鸡的心脏、肝脏、肺脏、小肠、脾脏、肾脏、喉头、气管等内脏器官，每只鸡的上述脏器混合在一起研磨作为一个病料。置于灭菌后的研钵中进行研磨，充分研磨后按样品的3倍量加无菌生理盐水，置于20℃冰箱中反复冻融3次。再次研磨后，8000 g/min离心5min，取上清，用0.22μm滤器过滤后，保留待用。
1.2.2 病料的PCR诊断
根据其是呼吸道疾病的基本判断，对病料进行PCR诊断，对临床上常见的可能造成呼吸道感染的病原体进行初步确定。
1.2.2.1病毒RNA的提取
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 病原2
1.1.2 SPF鸡胚2
1.1.3 动物2
1.1.4 扩增测序引物2
1.1.5 试剂2
1.1.6 主要仪器与耗材2
1.2 方法 2
1.2.1 病料处理2
1.2.2 病料的PCR诊断3
1.2.2.1 病毒RNA提取3
1.2.2.2 病毒RNA的反转录RT和PCR扩增3
1.2.2.3 电泳和核酸胶纯化及测序3
1.2.2.4 基因的序列拼接及BLAST3
1.2.3 病毒扩增4
1.2.4 易感动物回归试验4
1.2.5 血凝血凝抑制试验4
1.2.6 电泳和核酸胶纯化及测序4
2 结果与分析4
2.1 病鸡解剖结果4
2.2 病毒PCR扩增后电泳图5
2.3 基因序列拼接及BLAST结果6
2.4 易感动物回归试验7
2.5 血凝血凝抑制试验结果8
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
2.6 再测序及序列比对分析9
2.6.1 再测序及前后比对分析9
2.6.2 与亚洲各地病毒毒株序列比对分析10
3 讨论 10
致谢11
参考文献11
鸡H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定
引言
禽流感(Avian Influenza，AI)是由正黏病毒科（Orthomyxoviridae），A型流感病毒属中任一亚型引起的家禽、野鸟和部分哺乳动物发病的一种传染病[13]。根据其表面抗原性不同，鉴别为17 种HA 和10 种NA亚型[4]。其中H9亚型属于LPAI，自从1994年陈伯伦等从广东某地分离到H9亚型AIV以来，该病便在我国家禽中广泛流行[5]。由于该病具有感染率高、传播范围广、传播迅速等流行特点，尤其是与其他病原混合感染后会引起禽类死亡，并且确诊方法繁琐耗时长，给养禽业造成巨大经济耗损，也威胁着许多哺乳动物及人类的安全[67]。因此及时准确高效的诊断H9型AIV是有效防控的重要举措。本试验旨在初步分离鉴定来自江苏省某养禽地可疑病料，确定其感染H9亚型AIV，为禽养生产提供有效的诊断意见，便于及时治疗及免疫防控，以减少H9亚型AIV的发生所带来的经济损失。
材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 病原
病鸡来源：江苏省某地区养殖场，病鸡3只。
1. 1. 2 SPF鸡胚
9~11日龄SPF鸡胚，购自南京天邦生物科技有限公司。
1. 1. 3 动物
SPF非免疫鸡，购自南京天邦生物科技有限公司。
1. 1. 4 扩增测序引物
病毒鉴定用引物均由实验室制备、保存。H9亚型AIV基因扩增引物：上 游 5′ AGCGAAAGCGGGG3′ ;下 游 5′AGTAGAAACAAGGGTGTTTT3′。
HA 基 因 测 序 引 物 : R320 : 5′TAGGACCATTCTCTTCCTCC3′ ;
F186 :5′CACACAGAGCATAATGGGAT3′;
F580 : 5′CATTCTTTTCATGTGGGGCA3′ ;
F950 :5′TAAGTAAGTATGCATTTGGA3′;
F1350:5′CTGCTTGAAAACCAGAAAAC3′。
1. 1. 5 试剂
生理盐水自配，pH6.8～7.0； 1%鸡红细胞溶液，实验室配制，现配现用；反转录酶（MMLV）、RNase Out、10 mM dNTP、5×Buffer、10× PCR Buffer、2.5 mM dNTP、25 mM MgCl2、聚合酶（E×Taq）等，均购自TaKaRa公司；琼脂糖（BIOWEST AGAROSE G10），购自Gene Company LTD；RNA/DNA提取试剂盒和胶回收试剂盒，均购自康宁生命科学有限公司。
1. 1. 6 主要仪器与耗材
0.22μm微孔滤膜过滤器，Millipore lreland Ltd.产品；PCR仪，购自TaKaRa公司；电泳仪，购自南京普阳科学仪器研究所；全自动凝胶成像分析仪（JS680B），购自培清有限公司；高压锅（SY450），购自徐州圣业医疗器械有限责任公司。
其他材料和仪器：固体石蜡、打孔器、注射器、剪刀、镊子、离心机、研钵、超净工作台、70℃冰箱、20℃冰箱等。
1.2 方法
1.2.1 病料处理
主诉症状：该养禽地采用标准化鸡舍饲养，使用全价饲料兼自配料喂养，近期接连出现精神抑郁，产蛋率下降，蛋壳色泽变淡、变薄，少量眼角分泌物变多，面部肿胀，有轻度的呼吸啰音，饮食量下降，个别病禽出现腹泻下痢，严重的拒食，渴欲明显增强，嗉囊积液，鸡群出现营养不良、逐渐消瘦等症状。病初期，养殖人员认为是传染性鼻炎，磺胺类药物给药，效果并不明显。
病料用高压消毒后的手术剪分别解剖，无菌采集3份病鸡的心脏、肝脏、肺脏、小肠、脾脏、肾脏、喉头、气管等内脏器官，每只鸡的上述脏器混合在一起研磨作为一个病料。置于灭菌后的研钵中进行研磨，充分研磨后按样品的3倍量加无菌生理盐水，置于20℃冰箱中反复冻融3次。再次研磨后，8000 g/min离心5min，取上清，用0.22μm滤器过滤后，保留待用。
1.2.2 病料的PCR诊断
根据其是呼吸道疾病的基本判断，对病料进行PCR诊断，对临床上常见的可能造成呼吸道感染的病原体进行初步确定。
1.2.2.1病毒RNA的提取
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