探索puma和foxo1在小鼠卵巢颗粒细胞中的表达关系
:颗粒细胞凋亡是卵巢闭锁的主要原因。已有研究表明，PUMA和 FoxO1与小鼠卵巢颗粒细胞的凋亡有关，但是二者在小鼠卵巢颗粒细胞凋亡中的表达关系还不清楚。因此，本实验通过Real-time PCR和Westernblot技术，检测了PUMA和 FoxO1在小鼠卵巢颗粒细胞中的表达。同时，通过基因沉默技术，研究了二者在小鼠卵巢颗粒细胞中的表达关系。 结果表明在氧化应激条件下，PUMA和FoxO1在小鼠卵巢颗粒细胞中均表达上调。另外，小鼠卵巢颗粒细胞体外培养时，用FoxO1shRNA 抑制FoxO1表达，PUMA表达也受到相应抑制。本研究为进一步研究小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的调控机制奠定了基础。
目录
摘要 1
Abstract 1
引言 1
1材料与方法 2
1．1 实验材料 2
1.1.1 实验动物 2
1.1.2 主要试剂耗材 2
1.1.3 仪器设备 2
1．2 实验方法 2
1.2.1分离颗粒细胞 2
1.2.2 体外培养颗粒细胞 2
1.2.3细胞凋亡检测 2
1.2.4 Realtime PCR 2
1.2.5 Western Blot 3
2结果与分析 4
2.1 在小鼠卵巢颗粒细胞中检测细胞凋亡 4
2.2 PUMA在小鼠卵巢颗粒细胞中的表达 4
2.2.1 PUMA在mRNA水平上的表达 4
2.2.2 PUMA在蛋白水平上的表达 4
2.3 FoxO1在小鼠卵巢颗粒细胞中的表达 5
2.3.1 FoxO1在mRNA水平上的表达 5
2.3.2 PUMA在蛋白水平上的表达 5
2.4 FoxO1与PUMA在小鼠卵巢颗粒细胞中的表达关系 5
3讨论 6
3.1小鼠卵巢颗粒细胞原代培养 6
3.2 在氧化应激的条件下，PUMA在小鼠卵巢颗粒细胞中表达上调 6
3.3 PUMA与FoxO1的表达关系 6
4 结论 7
致谢 7
参考文献 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
7
探讨PUMA和FoxO1在小鼠卵巢颗粒细胞中的表达关系
引言
哺乳动物卵泡闭锁的根本原因在于卵泡内颗粒细胞的凋亡。卵巢颗粒细胞凋亡过程的生物学特征主要表现为：核小体DNA解体成片段、细胞萎缩、细胞膜起泡以及形成凋亡小体等（Adams et al.,1998）。已有的研究对卵巢颗粒细胞精确的凋亡调控途径以及受体细胞内信号通路的机制还没有非常明确，但是对于参与其中的细胞因子形成了共识，如卵泡存活因子（FSH、ILlp、Bcl2、IGFI等）和促凋亡因子（Bax、Caspase、FASL和抑制素等）。
PUMA是余健于2001年在直结肠癌细胞的研究中发现的促凋亡蛋白，它属于Bcl2家族，具有强大的促凋亡能力（Yu et al, 2001；Yu et al,2003；Fricker & Tolkovsky，2010；Ghiotto et al,2010）。迄今， PUMA是肿瘤治疗和研究领域最有研究价值的蛋白之一（Zong,2001; Green & Kroemer, 2004;Chipuk &Green,2009;Fricker & Tolkovsky，2010），而对小鼠卵巢颗粒细胞的研究刚刚开始（邹冬玲，2014）。
Foxo家族的转录因子活跃于细胞核内外，在细胞的分化、增殖、抗氧化和凋亡等方面发挥重要的作用（朱允和，2014）。已有研究表明：FoxO1蛋白在小鼠卵巢颗粒细胞的正常凋亡以及癌变中均起着至关重要的作用（Burgering et al., 2003）。FoxO1促凋亡调控的相关蛋白主要有：Fas/FasL蛋白、TRAIL/TRAILRs蛋白、Bcl2蛋白家族和Caspase蛋白家族。FoxO1转录因子通过影响靶基因的表达从而发挥在细胞中的作用(卢忠燕，2009)，然而对于PUMA和FoxO1这两种蛋白在卵巢颗粒细胞凋亡机制中的表达关系尚不清楚。因此，本课题以小鼠卵巢颗粒细胞为研究对象来研究二者的表达关系。
1材料与方法
1．1 实验材料
1.1.1 实验动物
3周龄(体重1719克)的SPF级雌性昆明小鼠,购自南京市青龙山实验动物繁殖中心。小鼠饲养在人工控温室(2225℃)和人工光照(14L10D)的动物房中,水瓶饮水和自由采食。
1.1.2 主要试剂耗材
（1）细胞培养试剂
DMEM/F12培养基、小牛血清、NaHeo3、PMSG、PBS、NaZHpo4、胰酶、青霉素(penieillin)、链霉素(streptomysin)、酒精、细胞培养板、培养皿、针式滤器。
（2）凋亡检测试剂
过氧化氢、Hoechst33258
1.1.3 仪器设备
ABI实时定量PCR系统，CO2培养箱，梯度PCR仪，凝胶成像自动分析系统，超速冷冻离心机，荧光分光光度计，紫外分光光度计，激光共聚焦显微镜，各种电泳设备。
1．2 实验方法
1.2.1分离颗粒细胞
通过对3周龄小鼠腹腔注射10IU PMSG，使其发情，48h后颈椎脱臼将其处死，无菌条件下剖腹取出其双侧卵巢，立即放入盛有完全培养液的培养皿内，在体显微镜下用1ml针头刺破卵泡，再将卵泡液(含颗粒细胞)挤压入另一培养基中，放入5%CO2培养箱中进行培养。
1.2.2 体外培养颗粒细胞
待培养皿内的颗粒细胞贴壁90%左右，将培养基完全吸出，PBS洗涤一次，再过滤，将细胞放在装有小牛血清（10%）的DMEM/F12培养液中，在5%CO2培养箱中培养67天。
1.2.3细胞凋亡检测
细胞培养48h，分别收集上清和贴壁细胞，离心，弃液，用Hoechst33258染细胞核，镜下检查细胞凋亡；
1.2.4 Realtime PCR
1.2.4.1引物设计，序列如下：
表1 引物序列设计
Table1 Primer sequences design
Protein
?Primer sequence
PUMA
F: 5ATGGCGGACGACCTCAAC3
目录
摘要 1
Abstract 1
引言 1
1材料与方法 2
1．1 实验材料 2
1.1.1 实验动物 2
1.1.2 主要试剂耗材 2
1.1.3 仪器设备 2
1．2 实验方法 2
1.2.1分离颗粒细胞 2
1.2.2 体外培养颗粒细胞 2
1.2.3细胞凋亡检测 2
1.2.4 Realtime PCR 2
1.2.5 Western Blot 3
2结果与分析 4
2.1 在小鼠卵巢颗粒细胞中检测细胞凋亡 4
2.2 PUMA在小鼠卵巢颗粒细胞中的表达 4
2.2.1 PUMA在mRNA水平上的表达 4
2.2.2 PUMA在蛋白水平上的表达 4
2.3 FoxO1在小鼠卵巢颗粒细胞中的表达 5
2.3.1 FoxO1在mRNA水平上的表达 5
2.3.2 PUMA在蛋白水平上的表达 5
2.4 FoxO1与PUMA在小鼠卵巢颗粒细胞中的表达关系 5
3讨论 6
3.1小鼠卵巢颗粒细胞原代培养 6
3.2 在氧化应激的条件下，PUMA在小鼠卵巢颗粒细胞中表达上调 6
3.3 PUMA与FoxO1的表达关系 6
4 结论 7
致谢 7
参考文献 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
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探讨PUMA和FoxO1在小鼠卵巢颗粒细胞中的表达关系
引言
哺乳动物卵泡闭锁的根本原因在于卵泡内颗粒细胞的凋亡。卵巢颗粒细胞凋亡过程的生物学特征主要表现为：核小体DNA解体成片段、细胞萎缩、细胞膜起泡以及形成凋亡小体等（Adams et al.,1998）。已有的研究对卵巢颗粒细胞精确的凋亡调控途径以及受体细胞内信号通路的机制还没有非常明确，但是对于参与其中的细胞因子形成了共识，如卵泡存活因子（FSH、ILlp、Bcl2、IGFI等）和促凋亡因子（Bax、Caspase、FASL和抑制素等）。
PUMA是余健于2001年在直结肠癌细胞的研究中发现的促凋亡蛋白，它属于Bcl2家族，具有强大的促凋亡能力（Yu et al, 2001；Yu et al,2003；Fricker & Tolkovsky，2010；Ghiotto et al,2010）。迄今， PUMA是肿瘤治疗和研究领域最有研究价值的蛋白之一（Zong,2001; Green & Kroemer, 2004;Chipuk &Green,2009;Fricker & Tolkovsky，2010），而对小鼠卵巢颗粒细胞的研究刚刚开始（邹冬玲，2014）。
Foxo家族的转录因子活跃于细胞核内外，在细胞的分化、增殖、抗氧化和凋亡等方面发挥重要的作用（朱允和，2014）。已有研究表明：FoxO1蛋白在小鼠卵巢颗粒细胞的正常凋亡以及癌变中均起着至关重要的作用（Burgering et al., 2003）。FoxO1促凋亡调控的相关蛋白主要有：Fas/FasL蛋白、TRAIL/TRAILRs蛋白、Bcl2蛋白家族和Caspase蛋白家族。FoxO1转录因子通过影响靶基因的表达从而发挥在细胞中的作用(卢忠燕，2009)，然而对于PUMA和FoxO1这两种蛋白在卵巢颗粒细胞凋亡机制中的表达关系尚不清楚。因此，本课题以小鼠卵巢颗粒细胞为研究对象来研究二者的表达关系。
1材料与方法
1．1 实验材料
1.1.1 实验动物
3周龄(体重1719克)的SPF级雌性昆明小鼠,购自南京市青龙山实验动物繁殖中心。小鼠饲养在人工控温室(2225℃)和人工光照(14L10D)的动物房中,水瓶饮水和自由采食。
1.1.2 主要试剂耗材
（1）细胞培养试剂
DMEM/F12培养基、小牛血清、NaHeo3、PMSG、PBS、NaZHpo4、胰酶、青霉素(penieillin)、链霉素(streptomysin)、酒精、细胞培养板、培养皿、针式滤器。
（2）凋亡检测试剂
过氧化氢、Hoechst33258
1.1.3 仪器设备
ABI实时定量PCR系统，CO2培养箱，梯度PCR仪，凝胶成像自动分析系统，超速冷冻离心机，荧光分光光度计，紫外分光光度计，激光共聚焦显微镜，各种电泳设备。
1．2 实验方法
1.2.1分离颗粒细胞
通过对3周龄小鼠腹腔注射10IU PMSG，使其发情，48h后颈椎脱臼将其处死，无菌条件下剖腹取出其双侧卵巢，立即放入盛有完全培养液的培养皿内，在体显微镜下用1ml针头刺破卵泡，再将卵泡液(含颗粒细胞)挤压入另一培养基中，放入5%CO2培养箱中进行培养。
1.2.2 体外培养颗粒细胞
待培养皿内的颗粒细胞贴壁90%左右，将培养基完全吸出，PBS洗涤一次，再过滤，将细胞放在装有小牛血清（10%）的DMEM/F12培养液中，在5%CO2培养箱中培养67天。
1.2.3细胞凋亡检测
细胞培养48h，分别收集上清和贴壁细胞，离心，弃液，用Hoechst33258染细胞核，镜下检查细胞凋亡；
1.2.4 Realtime PCR
1.2.4.1引物设计，序列如下：
表1 引物序列设计
Table1 Primer sequences design
Protein
?Primer sequence
PUMA
F: 5ATGGCGGACGACCTCAAC3
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