用hi方法和elisa方法对兔出血症基因工程疫苗兔体进行检测
血清中RHDV特异性抗体的水平直接反映家兔对RHDV的保护力，因此建立兔出血症病毒抗体ELISA方法对兔群抗体水平进行监测十分必要，同时为兔出血症免疫监测和预防控制提供科学的技术手段。为了更好的检测兔出血症病毒免疫水平情况，建立了优化反应条件的ELISA方法，并应用该方法与HI方法对免疫周期内家兔免疫状况进行监测，对免疫后不同时间（1、2、3、4、5、6、7、8个月）的血清样品进行检测，监测家兔免疫状况，了解家兔体液免疫状况。旨在为检测兔出血症病毒（RHDV）抗体提供一种特异、敏感、快速、操作简便、经济的检测方法，进而为兔出血症预防控制和免疫检测等提供科学的技术手段。
目录
摘要3
关键词 3
Abstract3
Keywords3
引言3
1 材料与方法4
1.1 材料4
1.2 HI方法4
1.3 ELISA方法 6
2 实验结果6
2.1 HI方法测定结果6
2.2 ELISA方法结果7
3 小结8
致谢8
参考文献9
HI和ELISA方法监测兔出血症基因工程疫苗抗体水平的研究
引言
兔出血症是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的兔的一种急性、败血性、烈性传染病，以呼吸系统出血、肝坏死及实质脏器水肿、淤血及出血性变化为主要特征。我国是养兔大国，养兔业正不断向规模化养殖发展，为确保家兔健康养殖，提高养殖户的经济收入，同时为确保进出口家兔的品质以及家兔流通市场的安全性，必须进行严格的疫情监测。目前，检测RHDV抗体的方法有血凝抑制法、ELISA等［1］。血凝抑制法由于受多种因素的影响往往重复性不好；以病毒作为包被抗原的ELISA往往因病毒纯化不良等因素的影响，易出现非特异性。本研究通过分子生物学技术，利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达兔出血症病毒衣壳蛋白VP60，以此蛋白作为兔出血症血凝抑制试验的四单位病毒的抗原，对结果的判定及标准化的执行极其有利［2］。
材料与方法
材料 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
1.1.1 人“O“型红细胞； 兔出血症死亡兔肝脏；RHDV重组VP60蛋白；对照样品：阳性对照为兔出血症阳性血清（已知HI效价），阴性对照为SPF兔出血清。待检兔血清样本（即免疫兔出血症基因工程疫苗1、2、3、4、5、6、7、8个月后的血清）由江苏省农科院兽医所兔病组采集并保存。
1.1.2 仪器与设备
离心机：要求最大离心力在12000×g以上；温箱；恒温水浴锅；2~8℃冰箱；微量移液器若干；微型震荡器；50孔微量凝集板若干。
1.2 HI方法
1.2.1人“O“型红细胞；兔出血症死亡兔肝脏；RHDV重组VP60蛋白；被检样品待检兔血清；对照样品，阳性对照为兔出血症阳性血清（已知HI效价），阴性对照为SPF兔出血清。
1.2.2方法步骤
1.2.3人“O”型红细胞和1%人“O”型红细胞悬液的制备
取人“O”型红细胞以20倍量PBS（0.1mol/l,pH值在7.07.2）混匀洗涤红细胞，2500r/min离心5min，弃上清，重复洗涤4次，洗涤后的红细胞用PBS配成1%悬液，置4摄氏度备用。
1.2.4抗原制备
1.2.4．1 兔出血症死亡兔肝脏悬液的制备
取兔出血症死亡兔肝脏，剪碎，按1：10加入PBS后匀浆，反复冻融3次，再以1000*g离心30min，取上清备用。
1.2.4.2 RHDV重组VP60蛋白的制备
将重组兔出血症病毒VP60杆状病毒接种SF9昆虫细胞，5日后，收集细胞培养物，反复冻融3次后，以1000*g离心5min，取上清即为RHDV重组蛋白VP60蛋白。
1.2.5 抗原的标准
1.2.5.1 兔出血症死亡兔肝脏悬液的标准
兔出血症死亡的兔肝脏悬液对人“O”型红细胞凝集效价不低于1:256[5].
1.2.5.2 RHDV重组VP60蛋白的标准
RHDV重组VP60蛋白的标准对人“O”型红细胞凝集效价不低于1:256.
1.2.6 抗原工作液
根据测定对RHDV重组VP60蛋白和/或兔出血症死亡肝脏悬液对红细胞凝集效价，用PBS配制成4个血凝单位对抗原工作液[6]。
1.2.7 SPF兔阴性血清
兔出血症阳性血清及待检血清处理 取100μL，加入10μL人“O”型红细胞，28摄氏度作用1小时，以2500r/min离心5min，收集上清液备用。
1.2.8 血凝抑制（HI）试验操作［10］
1.2.8.1 在50孔u型板上，自第一孔至第十个孔，每孔加入PBS50μl。
1.2.8.2 吸取待检血清50μl于第一孔，充分混匀后用50μl移液器等量倍比稀释至第十孔，稀释后第十孔弃去50μl。
1.2.8.3 每孔分别加4个血清单位的抗原50μl，摇匀，37摄氏度温箱作用60分钟。
1.2.8.4 每孔各加入人“O”型红细胞50μl，立即至于微型震荡器上摇匀，于4摄氏度冰箱静置60分钟，待PBS对照孔的红细胞完全沉淀后观察结果。
1.2.8.5 每次测定须设已知效价的兔出血症阳性血清对照、阴性血清对照、4个血凝单位对照、待检处理血清对照、PBS对照。
1.3 重组 VP60 蛋白间接 ELISA 方法
1.3.1试剂［9］
a． 包被液(0.05 mol/L pH 9.6 碳酸盐缓冲液)使用前高压灭菌
Na2CO3 0.16g + NaHCO3 0.30g 溶于100ml ddH2O 调节pH至9.6
b．洗涤及稀释液(0.01 mol/L pH 7.4 磷酸盐NaCl缓冲液(PBS)， 内含0.05% Tween20)。
PBS使用前高压灭菌：NaCl 4.5g + NaH2PO42H20 0.15g + Na2HPO412H20 1.45g溶于500ml ddH2O调节pH至pH 7.4，
使用前+Tween20 0.25ml。
c．封闭液(2% 明胶 PBST)
目录
摘要3
关键词 3
Abstract3
Keywords3
引言3
1 材料与方法4
1.1 材料4
1.2 HI方法4
1.3 ELISA方法 6
2 实验结果6
2.1 HI方法测定结果6
2.2 ELISA方法结果7
3 小结8
致谢8
参考文献9
HI和ELISA方法监测兔出血症基因工程疫苗抗体水平的研究
引言
兔出血症是由兔出血症病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）引起的兔的一种急性、败血性、烈性传染病，以呼吸系统出血、肝坏死及实质脏器水肿、淤血及出血性变化为主要特征。我国是养兔大国，养兔业正不断向规模化养殖发展，为确保家兔健康养殖，提高养殖户的经济收入，同时为确保进出口家兔的品质以及家兔流通市场的安全性，必须进行严格的疫情监测。目前，检测RHDV抗体的方法有血凝抑制法、ELISA等［1］。血凝抑制法由于受多种因素的影响往往重复性不好；以病毒作为包被抗原的ELISA往往因病毒纯化不良等因素的影响，易出现非特异性。本研究通过分子生物学技术，利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达兔出血症病毒衣壳蛋白VP60，以此蛋白作为兔出血症血凝抑制试验的四单位病毒的抗原，对结果的判定及标准化的执行极其有利［2］。
材料与方法
材料 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
1.1.1 人“O“型红细胞； 兔出血症死亡兔肝脏；RHDV重组VP60蛋白；对照样品：阳性对照为兔出血症阳性血清（已知HI效价），阴性对照为SPF兔出血清。待检兔血清样本（即免疫兔出血症基因工程疫苗1、2、3、4、5、6、7、8个月后的血清）由江苏省农科院兽医所兔病组采集并保存。
1.1.2 仪器与设备
离心机：要求最大离心力在12000×g以上；温箱；恒温水浴锅；2~8℃冰箱；微量移液器若干；微型震荡器；50孔微量凝集板若干。
1.2 HI方法
1.2.1人“O“型红细胞；兔出血症死亡兔肝脏；RHDV重组VP60蛋白；被检样品待检兔血清；对照样品，阳性对照为兔出血症阳性血清（已知HI效价），阴性对照为SPF兔出血清。
1.2.2方法步骤
1.2.3人“O”型红细胞和1%人“O”型红细胞悬液的制备
取人“O”型红细胞以20倍量PBS（0.1mol/l,pH值在7.07.2）混匀洗涤红细胞，2500r/min离心5min，弃上清，重复洗涤4次，洗涤后的红细胞用PBS配成1%悬液，置4摄氏度备用。
1.2.4抗原制备
1.2.4．1 兔出血症死亡兔肝脏悬液的制备
取兔出血症死亡兔肝脏，剪碎，按1：10加入PBS后匀浆，反复冻融3次，再以1000*g离心30min，取上清备用。
1.2.4.2 RHDV重组VP60蛋白的制备
将重组兔出血症病毒VP60杆状病毒接种SF9昆虫细胞，5日后，收集细胞培养物，反复冻融3次后，以1000*g离心5min，取上清即为RHDV重组蛋白VP60蛋白。
1.2.5 抗原的标准
1.2.5.1 兔出血症死亡兔肝脏悬液的标准
兔出血症死亡的兔肝脏悬液对人“O”型红细胞凝集效价不低于1:256[5].
1.2.5.2 RHDV重组VP60蛋白的标准
RHDV重组VP60蛋白的标准对人“O”型红细胞凝集效价不低于1:256.
1.2.6 抗原工作液
根据测定对RHDV重组VP60蛋白和/或兔出血症死亡肝脏悬液对红细胞凝集效价，用PBS配制成4个血凝单位对抗原工作液[6]。
1.2.7 SPF兔阴性血清
兔出血症阳性血清及待检血清处理 取100μL，加入10μL人“O”型红细胞，28摄氏度作用1小时，以2500r/min离心5min，收集上清液备用。
1.2.8 血凝抑制（HI）试验操作［10］
1.2.8.1 在50孔u型板上，自第一孔至第十个孔，每孔加入PBS50μl。
1.2.8.2 吸取待检血清50μl于第一孔，充分混匀后用50μl移液器等量倍比稀释至第十孔，稀释后第十孔弃去50μl。
1.2.8.3 每孔分别加4个血清单位的抗原50μl，摇匀，37摄氏度温箱作用60分钟。
1.2.8.4 每孔各加入人“O”型红细胞50μl，立即至于微型震荡器上摇匀，于4摄氏度冰箱静置60分钟，待PBS对照孔的红细胞完全沉淀后观察结果。
1.2.8.5 每次测定须设已知效价的兔出血症阳性血清对照、阴性血清对照、4个血凝单位对照、待检处理血清对照、PBS对照。
1.3 重组 VP60 蛋白间接 ELISA 方法
1.3.1试剂［9］
a． 包被液(0.05 mol/L pH 9.6 碳酸盐缓冲液)使用前高压灭菌
Na2CO3 0.16g + NaHCO3 0.30g 溶于100ml ddH2O 调节pH至9.6
b．洗涤及稀释液(0.01 mol/L pH 7.4 磷酸盐NaCl缓冲液(PBS)， 内含0.05% Tween20)。
PBS使用前高压灭菌：NaCl 4.5g + NaH2PO42H20 0.15g + Na2HPO412H20 1.45g溶于500ml ddH2O调节pH至pH 7.4，
使用前+Tween20 0.25ml。
c．封闭液(2% 明胶 PBST)
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