猪圆环病毒2型疫苗（ZJC）株生产艺的优化
猪圆环病毒2型疫苗（ZJC）株生产艺的优化[20200507220311]
摘 要：为了降低生产成本，简化猪圆环病毒2型（ZJ/C）株疫苗的生产工艺，在不影响猪圆环病毒2型疫苗效价的前提下，本试验从猪圆环病毒2型（ZJ/C）株细胞苗生产的半成品入手，分别从来自不同厂家的犊牛血清、消化细胞的浓度以及灭活细胞灭活剂的不同等方面研究，通过测定最终效价，结合考虑规模化生产的生产成本，发现PK-15用9%血清和1%双抗MEM生长液接毒，用0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA·4Na消化细胞，且在瓶壁出现划痕时，需放置于温室中进行进一步消化，48h后换成3%血清+ 0.5%双抗MEM。84 h后，无病变，需用IFA检测后进行收获，冻融3次然后收毒为最优方案。目前生产上大多用甲醛做灭活剂，而甲醛是一种致癌物，灭活制备灭活疫苗尚有其许多不足之处，因此对于灭活剂的研究还有待进一步开展。
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关键字:猪圆环病毒2型；生产工艺；PK-15细胞
目录
摘 要 1
关键词 1
Abstract: 1
Key Words: 1
引言 1
1 材料与方法 1
1.1 材料 1
1.1.1 细胞 1
1.1.2 病毒 1
1.1.3 试剂 2
1.2 方法 2
1.2.1接毒（同步传代） 2
1.2.2 换液 3
1.2.3 收获 3
1.2.4 冻融 3
1.2.5收毒、菌检 3
1.2.6 灭活 3
1.2.7 测定效价用间接免疫荧光法测定 3
2 实验结果与分析 4
2.1 不同血清传代细胞实验最终病毒液测得效价：劲牛>博奥泰克>四季青 4
2.2 消化液浓度 4
2.3接毒比例 4
2.4病毒液收获时间段 4
2.5灭活方式 5
2.6冻融次数 5
2.7 接毒、换液方式 6
3 讨论 6
3.1 不同消化液浓度对PK-15细胞生长的影响 6
3.2 灭活剂 6
3.2.1甲醛 6
3.2.2 β-丙内酯 7
4 结论 7
4.1 细胞培养最优条件 7
4.2 灭活剂 7
致谢 8
参考文献 8
猪圆环病毒2型疫苗（ZJ/C）株生产工艺的优化
引言
猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2, PCV2）是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征（Postwea *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
ning multisystemic wasting syndrome, PMWS）的病原[1,2]，也能引起猪PDNS, PRDC以及母猪繁殖障碍等疾病[3]，给全球养猪业造成了巨大经济损失。PCV2是一种DNA病毒，对外界环境抵抗力较强，猪群一旦感染就很难消除。PCV2感染可以破坏动物机体的免疫系统，造成严重的免疫抑制，容易诱发多种细菌及病毒的混合感染与继发感染[4,5]。疫苗免疫接种是防控PCV2感染的有效手段，有关PCV2疫苗的研究已成为国内外学者的关注热点。迄今为止，欧美几家跨国公司已先后推出商品化的PCV2灭活疫苗、亚单位疫苗及嵌合病毒疫苗，国内也已研制出PCV2灭活疫苗，这些疫苗的推广应用为有效防控猪圆环病毒病发挥了重要作用。
在疫苗的研制中，病毒抗原含量对免疫效果影响较大。兽医届试图把PCV2适应于体外人工细胞的培养，经组织培养病毒增殖到较高毒价后制备成疫苗以用于预防猪圆环病毒病。目前，病毒经组织培养增殖到较高毒价后制备成疫苗以用于预防猪圆环病毒病。目前，病毒经组织培养增殖尚没有重大突破，成为，成为病毒学研究的难题。应用生物反应器和微载体培养贴壁细胞具有高比表面积、细胞产量高，便于监测、控制和取样，生产规模容易放大，不易染菌等优点，工业上广泛应用于生产狂犬病毒、脊髓灰质炎病毒等疫苗，为此，本试验研究并探讨利用生物反应器和微载体培养PK-15细胞生产PCV2病毒的技术可行性，为进一步优化培养过程和大规模工业化生产疫苗提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞
PK-15细胞（无PCV1污染）由浙江大学提供。
1.1.2 病毒
来自江苏、上海、山东及浙江等地的5个猪场，病猪死亡前主要表现为体温升高、消瘦。呼吸困难等临床症状，剖检取有病变的淋巴结、肺和脾脏组织，经PCR测定证实为PCV2后进行处理，研磨粉碎，加入PBS液（1：5），-20℃反复冻融3次，5000r/min离心取上清液，用灭菌0.22μm滤膜过滤除菌，命名为PCV2( ZJ/C)株，分装后置-70℃保存备用。
1.1.3 各种试剂
MEM培养基、血清（劲牛、金源康、博奥泰克、四季青的犊牛血清）、消化液（0.25%、0.15%、0.10%、0.05%的胰蛋白酶和 0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA?4Na）、双抗（2万单位）、PBS溶液、消毒液。
1.2 方法
半成品生产工艺流程图
1.2.1接毒（同步传代）
1.2.1.1病毒生长液配制：分别取9%的劲牛、金源康、博奥泰克、四季青犊牛血清加入MEM培养基，1%双抗溶液和种毒混匀。
1.2.1.2接毒：将培养至48小时的PK-15细胞在温室中进行观察，挑选镜检细胞形态良好、分布均匀且长满单层的细胞瓶，倒入PBS转动细胞瓶洗细胞面两次。
1.2.2.3消化细胞：向细胞瓶中加入适量细胞消化液（能漫过细胞面即可）待大部分细胞脱离瓶壁时加入病毒生长液，终止消化。
1.2.2.4分瓶：根据细胞分散前镜下所观察到的细胞致密度，按1:3的分散率补足病毒生长液，将病毒生长液充分混匀，根据分散率均匀地分装在无菌的细胞瓶中，摇匀细胞生长液，将细胞培养瓶放在转瓶机上，转瓶机已调好转速为 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
11r/h，置于37℃温室中继续培养。
1.2.2.5 不同接毒比例：分别配制总量的0.5%、1%、2%、3%、4%的种毒、9%的血清加入MEM培养基，1%双抗溶液混匀。如上方法进行传代加接毒，并做好标记。
1.2.2.6 不同消化液处理细胞：向细胞瓶中分别加入0.25%、0.15%、0.10%、0.05%的胰蛋白酶和 0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA4Na 溶液 1.5ml水平方向转动细胞瓶，使细胞分散液均匀漫过细胞面约1－2分钟，密切观察细胞面的变化，当细胞面上出现肉眼可见毛玻璃样，或出现针尖大小的缝隙，或因细胞分散液在瓶内转动而出现细细的划痕时，即可倒掉细胞分散液并尽量倒净，将细胞瓶水平放置在桌面上，待细胞面出现较大裂痕时，摇晃后细胞能脱离瓶壁，此时向瓶内加入病毒生长液，终止消化，分瓶培养并观察[6]。
1.2.2 换液
将接毒后的PK-15细胞在温室中进行观察，剔除不好的和污染的转瓶，将正常的PK-15细胞瓶按接毒瓶分别于接毒24h,48h后换成加入3%劲牛、金源康、博奥泰克、四季青犊牛血清的MEM培养基，放置与转瓶机温室培养。
1.2.3 收获
换液后每天观察细胞生长情况，细胞呈致密等现象，并及时做好记录，分别与56h、64h、72h、80h、88h、96h、104h为收获时间将转瓶机推至-15℃冷库冻结进行收获。同时观察细胞培养瓶颜色和澄明度，剔除浑浊（污染）、颜色异常（紫色）的细胞瓶。
1.2.4 冻融
1.2.4.1摇瓶：将收获的细胞瓶在冷库中过夜后拉出，放置室温融化，当细胞瓶中冰块化至1/3左右时（融化太多影响摇瓶，融化太少容易撞裂细胞瓶），摇动转瓶中的冰水混合物，使冰块将细胞瓶内壁的细胞划下，肉眼见转瓶瓶壁透明即可。
5 6 7 7.0 7.16 7.0
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摘 要：为了降低生产成本，简化猪圆环病毒2型（ZJ/C）株疫苗的生产工艺，在不影响猪圆环病毒2型疫苗效价的前提下，本试验从猪圆环病毒2型（ZJ/C）株细胞苗生产的半成品入手，分别从来自不同厂家的犊牛血清、消化细胞的浓度以及灭活细胞灭活剂的不同等方面研究，通过测定最终效价，结合考虑规模化生产的生产成本，发现PK-15用9%血清和1%双抗MEM生长液接毒，用0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA·4Na消化细胞，且在瓶壁出现划痕时，需放置于温室中进行进一步消化，48h后换成3%血清+ 0.5%双抗MEM。84 h后，无病变，需用IFA检测后进行收获，冻融3次然后收毒为最优方案。目前生产上大多用甲醛做灭活剂，而甲醛是一种致癌物，灭活制备灭活疫苗尚有其许多不足之处，因此对于灭活剂的研究还有待进一步开展。
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关键字:猪圆环病毒2型；生产工艺；PK-15细胞
目录
摘 要 1
关键词 1
Abstract: 1
Key Words: 1
引言 1
1 材料与方法 1
1.1 材料 1
1.1.1 细胞 1
1.1.2 病毒 1
1.1.3 试剂 2
1.2 方法 2
1.2.1接毒（同步传代） 2
1.2.2 换液 3
1.2.3 收获 3
1.2.4 冻融 3
1.2.5收毒、菌检 3
1.2.6 灭活 3
1.2.7 测定效价用间接免疫荧光法测定 3
2 实验结果与分析 4
2.1 不同血清传代细胞实验最终病毒液测得效价：劲牛>博奥泰克>四季青 4
2.2 消化液浓度 4
2.3接毒比例 4
2.4病毒液收获时间段 4
2.5灭活方式 5
2.6冻融次数 5
2.7 接毒、换液方式 6
3 讨论 6
3.1 不同消化液浓度对PK-15细胞生长的影响 6
3.2 灭活剂 6
3.2.1甲醛 6
3.2.2 β-丙内酯 7
4 结论 7
4.1 细胞培养最优条件 7
4.2 灭活剂 7
致谢 8
参考文献 8
猪圆环病毒2型疫苗（ZJ/C）株生产工艺的优化
引言
猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2, PCV2）是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征（Postwea *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
ning multisystemic wasting syndrome, PMWS）的病原[1,2]，也能引起猪PDNS, PRDC以及母猪繁殖障碍等疾病[3]，给全球养猪业造成了巨大经济损失。PCV2是一种DNA病毒，对外界环境抵抗力较强，猪群一旦感染就很难消除。PCV2感染可以破坏动物机体的免疫系统，造成严重的免疫抑制，容易诱发多种细菌及病毒的混合感染与继发感染[4,5]。疫苗免疫接种是防控PCV2感染的有效手段，有关PCV2疫苗的研究已成为国内外学者的关注热点。迄今为止，欧美几家跨国公司已先后推出商品化的PCV2灭活疫苗、亚单位疫苗及嵌合病毒疫苗，国内也已研制出PCV2灭活疫苗，这些疫苗的推广应用为有效防控猪圆环病毒病发挥了重要作用。
在疫苗的研制中，病毒抗原含量对免疫效果影响较大。兽医届试图把PCV2适应于体外人工细胞的培养，经组织培养病毒增殖到较高毒价后制备成疫苗以用于预防猪圆环病毒病。目前，病毒经组织培养增殖到较高毒价后制备成疫苗以用于预防猪圆环病毒病。目前，病毒经组织培养增殖尚没有重大突破，成为，成为病毒学研究的难题。应用生物反应器和微载体培养贴壁细胞具有高比表面积、细胞产量高，便于监测、控制和取样，生产规模容易放大，不易染菌等优点，工业上广泛应用于生产狂犬病毒、脊髓灰质炎病毒等疫苗，为此，本试验研究并探讨利用生物反应器和微载体培养PK-15细胞生产PCV2病毒的技术可行性，为进一步优化培养过程和大规模工业化生产疫苗提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞
PK-15细胞（无PCV1污染）由浙江大学提供。
1.1.2 病毒
来自江苏、上海、山东及浙江等地的5个猪场，病猪死亡前主要表现为体温升高、消瘦。呼吸困难等临床症状，剖检取有病变的淋巴结、肺和脾脏组织，经PCR测定证实为PCV2后进行处理，研磨粉碎，加入PBS液（1：5），-20℃反复冻融3次，5000r/min离心取上清液，用灭菌0.22μm滤膜过滤除菌，命名为PCV2( ZJ/C)株，分装后置-70℃保存备用。
1.1.3 各种试剂
MEM培养基、血清（劲牛、金源康、博奥泰克、四季青的犊牛血清）、消化液（0.25%、0.15%、0.10%、0.05%的胰蛋白酶和 0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA?4Na）、双抗（2万单位）、PBS溶液、消毒液。
1.2 方法
半成品生产工艺流程图
1.2.1接毒（同步传代）
1.2.1.1病毒生长液配制：分别取9%的劲牛、金源康、博奥泰克、四季青犊牛血清加入MEM培养基，1%双抗溶液和种毒混匀。
1.2.1.2接毒：将培养至48小时的PK-15细胞在温室中进行观察，挑选镜检细胞形态良好、分布均匀且长满单层的细胞瓶，倒入PBS转动细胞瓶洗细胞面两次。
1.2.2.3消化细胞：向细胞瓶中加入适量细胞消化液（能漫过细胞面即可）待大部分细胞脱离瓶壁时加入病毒生长液，终止消化。
1.2.2.4分瓶：根据细胞分散前镜下所观察到的细胞致密度，按1:3的分散率补足病毒生长液，将病毒生长液充分混匀，根据分散率均匀地分装在无菌的细胞瓶中，摇匀细胞生长液，将细胞培养瓶放在转瓶机上，转瓶机已调好转速为 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
11r/h，置于37℃温室中继续培养。
1.2.2.5 不同接毒比例：分别配制总量的0.5%、1%、2%、3%、4%的种毒、9%的血清加入MEM培养基，1%双抗溶液混匀。如上方法进行传代加接毒，并做好标记。
1.2.2.6 不同消化液处理细胞：向细胞瓶中分别加入0.25%、0.15%、0.10%、0.05%的胰蛋白酶和 0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA4Na 溶液 1.5ml水平方向转动细胞瓶，使细胞分散液均匀漫过细胞面约1－2分钟，密切观察细胞面的变化，当细胞面上出现肉眼可见毛玻璃样，或出现针尖大小的缝隙，或因细胞分散液在瓶内转动而出现细细的划痕时，即可倒掉细胞分散液并尽量倒净，将细胞瓶水平放置在桌面上，待细胞面出现较大裂痕时，摇晃后细胞能脱离瓶壁，此时向瓶内加入病毒生长液，终止消化，分瓶培养并观察[6]。
1.2.2 换液
将接毒后的PK-15细胞在温室中进行观察，剔除不好的和污染的转瓶，将正常的PK-15细胞瓶按接毒瓶分别于接毒24h,48h后换成加入3%劲牛、金源康、博奥泰克、四季青犊牛血清的MEM培养基，放置与转瓶机温室培养。
1.2.3 收获
换液后每天观察细胞生长情况，细胞呈致密等现象，并及时做好记录，分别与56h、64h、72h、80h、88h、96h、104h为收获时间将转瓶机推至-15℃冷库冻结进行收获。同时观察细胞培养瓶颜色和澄明度，剔除浑浊（污染）、颜色异常（紫色）的细胞瓶。
1.2.4 冻融
1.2.4.1摇瓶：将收获的细胞瓶在冷库中过夜后拉出，放置室温融化，当细胞瓶中冰块化至1/3左右时（融化太多影响摇瓶，融化太少容易撞裂细胞瓶），摇动转瓶中的冰水混合物，使冰块将细胞瓶内壁的细胞划下，肉眼见转瓶瓶壁透明即可。
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