犬干扰素α4在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性分析
3为了制备高表达量且具有生物活性的犬干扰素α，将犬干扰素α4（CaIFN-α4）的密码子针对大肠杆菌优化后获得的成熟蛋白目的基因与pET28a载体连接，构建原核表达载体pET28a-CaIFN-α4，将其转入大肠杆菌Rosetta中之后用IPTG诱导表达，获得约23 KDa大小的CaIFN-α4的重组蛋白。经超声破碎获得干扰素包涵体，用尿素使包涵体变性，透析复性后利用组氨酸标签蛋白纯化方法获得纯化的CaIFN-α4。在MDCK细胞上检测纯化后的样品具有抗水疱性口炎病毒（VSV）活性，活性为4.15×105 U/mL。本研究成功地利用Rosetta表达了具有抗病毒活性的CaIFN-α4，为进一步研制高活性的CaIFN-α4的生产系统奠定了实验基础。
目录
引言
近年来，随宠物行业的快速发展，犬作为宠物中的主要成员，其所带来的健康隐患不容忽视[1]。犬类各种疾病的发病率也在逐年上升，这种上升趋势对犬产业的发展造成巨大威胁。犬病的种类复杂繁多，如犬瘟热、伪狂犬病等，不仅危害犬只，还危害其他物种，造成对生态系统的破坏。还有一些人兽共患病，对人类的危害极大。因此，从临床医学和人畜安全的角度出发，为综合防治犬病毒性疾病，需生产安全有效的药物。而干扰素可用于多种疾病的预防和治疗，尤其在抑制病毒、免疫系统调节等多方面都有很显著的疗效，犬干扰素的临床应用价值和应用潜力巨大[23]。
干扰素（IFN）是人体和其他动物体内非常重要的细胞因子。在特定诱导物的作用下，由效应细胞产生并分泌。它具有广谱抗病毒、抗肿瘤活性[45]和免疫调节功能[67]。一经问世，就引起了学者们的广泛关注。干扰素主要分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型[8]。其中，Ⅰ型IFN具有较强的抗病毒作用，可使机体通过极短的时间就处于抗病毒状态[9]。IFNα属于Ⅰ型干扰素。它是由白细胞受到特异性或非特异性抗原刺激产生的糖蛋白。它具有一定的种属特异性和抗病毒活性。它是IFN中最大的基因家族，可分为许多亚型。
由于大肠杆菌具有表达系统遗传背景清楚，表达目的基因水平高，培养周期短，抗污染能力强，操作简单，经济成本低等特点[10], 是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。且大肠杆菌表达系统是第一个表达外源蛋白的系统。这些外源蛋白通常以可溶性表达、分泌表达和包涵体的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
形式存在于大肠杆菌表达系统中。包涵体形式的蛋白质需要变性和复性来确保干扰素的活性[11]。
本研究旨在通过大肠杆菌表达出有活性的CaIFNα4，为进一步开发高活性CaIFNα4生产系统奠定实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、宿主菌及细胞、病毒
pET28a、E. coli BL2、宿主菌E. coli DH5α以及E. coli Rosetta均为本实验室保存。pMD19T载体为大连宝生生物工程有限公司产品。犬肾细胞（MDCK）、水疱性口炎病毒（VSV）为江苏省农业科学院兽医所禽病与生物兽药实验室保存。
1.1.2 主要试剂盒和试剂
DNA分子量标准BS5000为北京全式金生物技术有限公司产品，限制性内切酶EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ及连接试剂盒均为大连宝生生物工程有限公司产品。琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒为OMEGA公司产品。DMEM培养基为GIBCO公司产品，小牛血清为浙江天航生物有限公司产品。其它化学试剂均为分析纯。
1.1.3 主要仪器设备
纯水仪，滤器，酶标仪，凝胶成像系统，落地式低温高速离心机，二氧化碳恒温培养箱，PCR仪，高速台式离心机，恒温空气浴摇床，旋涡震荡器，双人单面超净工作台，高速台式低温高速离心机，倒置荧光显微镜，超声波破碎仪，电子天平，垂直板电泳系统，倒置显微镜，NanoDrop2000超微量分光光度计。
1.2 成熟CaIFNα4基因的获得
据Genbank中已发表的犬干扰素α4（CaIFNα4）的序列（Genbank序列号：AB102731），首先全基因序列是由武汉金开瑞生物工程有限公司得到的针对大肠杆菌碱基偏好性优化后的犬干扰素α4，全基因序列如下：
ATGGCACTGCCGTGTAGCTTTAGCGTTGCACTGGTTCTGCTGAGCTGTCATAGCCTGTGTTGTCTGGCATGTGATCTGCCGGATACCCATAGCCTGCGTAATTGGCGTGTTCTGACCCTGCTGGGCCAGATGCGTCGTCTGAGCGCAAGCAGCTGTGATCATTATACCACCGATTTTGCATTTCCGAAAGAACTGTTTGATGGTCAGCGTCTGCAAGAAGCACAGGCACTGAGCGTTGTTCATGTTATGACCCAGAAAGTTTTTCACCTGTTTTGCACCAATATGAGCAGCGCACCGTGGAATATGACACTGCTGGAAGAACTGTGTAGCGGTCTGAGTGAACAGCTGGATGATCTGGATGCATGTCCGCTGCAAGAGGCAGGTCTGGCAGAAACACCGCTGATGCATGAAGATAGCACCCTGCGTACCTATTTTCAGCGTATTAGCCTGTATCTGCAGGATCGTAATCATAGCCCGTGTGCATGGGAAATGGTTCGTGCAGAAATTGGTCGTAGCTTTTTTAGCCTGACCATCCTGCAAGAACGTGTTCGTCGTCGTAAATAA
以上述基因为模板设计一对引物，上游引物加入酶切位点EcoR Ⅰ，下游引物加上酶切位点Sal Ⅰ，上游：F：5′TAGAATTCAACATGTGTGATCTGCCGGATACCC3′(EcoR Ⅰ)，下游：R：5′GTCGACTCATTTACGACGACGAACA3′（Sal Ⅰ）。扩增该目的基因，降落PCR扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s；5260℃ 30 s；72℃ 1 min；35个循环，72℃ 10 min。预计扩增的目的基因片段的大小为512 bp。
将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，再使用凝胶回收纯化试剂盒回收PCR产物中目的片段，回收产物的操作如下：确定目标条带的位置并切下，将切下的凝胶块加入3倍凝胶体积量的GSB，60℃融化凝胶，注意液体受热均匀，待完全溶解后，加入10 μL浓度为3 M的醋酸钠溶液直至溶液变成黄色，可适量加入异丙醇，降至室温后，将其加入核酸纯化柱中，12000 r/min，离心1 min，弃流出液。加700 μL 洗脱液，12000 r/min，室温离心30 s，弃流出液。洗两遍，弃掉离心液后，装回柱子，12000 r/min，空离2 min，开盖2 min，挥发掉残余乙醇。将柱子放入新的EP管中，在核酸纯化柱的膜中央加入50 μL 的Elution Buffer，37℃温箱放置2 min后，12000 r/min离心1 min洗脱回收DNA。
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引言
近年来，随宠物行业的快速发展，犬作为宠物中的主要成员，其所带来的健康隐患不容忽视[1]。犬类各种疾病的发病率也在逐年上升，这种上升趋势对犬产业的发展造成巨大威胁。犬病的种类复杂繁多，如犬瘟热、伪狂犬病等，不仅危害犬只，还危害其他物种，造成对生态系统的破坏。还有一些人兽共患病，对人类的危害极大。因此，从临床医学和人畜安全的角度出发，为综合防治犬病毒性疾病，需生产安全有效的药物。而干扰素可用于多种疾病的预防和治疗，尤其在抑制病毒、免疫系统调节等多方面都有很显著的疗效，犬干扰素的临床应用价值和应用潜力巨大[23]。
干扰素（IFN）是人体和其他动物体内非常重要的细胞因子。在特定诱导物的作用下，由效应细胞产生并分泌。它具有广谱抗病毒、抗肿瘤活性[45]和免疫调节功能[67]。一经问世，就引起了学者们的广泛关注。干扰素主要分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型[8]。其中，Ⅰ型IFN具有较强的抗病毒作用，可使机体通过极短的时间就处于抗病毒状态[9]。IFNα属于Ⅰ型干扰素。它是由白细胞受到特异性或非特异性抗原刺激产生的糖蛋白。它具有一定的种属特异性和抗病毒活性。它是IFN中最大的基因家族，可分为许多亚型。
由于大肠杆菌具有表达系统遗传背景清楚，表达目的基因水平高，培养周期短，抗污染能力强，操作简单，经济成本低等特点[10], 是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。且大肠杆菌表达系统是第一个表达外源蛋白的系统。这些外源蛋白通常以可溶性表达、分泌表达和包涵体的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
形式存在于大肠杆菌表达系统中。包涵体形式的蛋白质需要变性和复性来确保干扰素的活性[11]。
本研究旨在通过大肠杆菌表达出有活性的CaIFNα4，为进一步开发高活性CaIFNα4生产系统奠定实验基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、宿主菌及细胞、病毒
pET28a、E. coli BL2、宿主菌E. coli DH5α以及E. coli Rosetta均为本实验室保存。pMD19T载体为大连宝生生物工程有限公司产品。犬肾细胞（MDCK）、水疱性口炎病毒（VSV）为江苏省农业科学院兽医所禽病与生物兽药实验室保存。
1.1.2 主要试剂盒和试剂
DNA分子量标准BS5000为北京全式金生物技术有限公司产品，限制性内切酶EcoR Ⅰ、Sal Ⅰ及连接试剂盒均为大连宝生生物工程有限公司产品。琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒、质粒提取试剂盒为OMEGA公司产品。DMEM培养基为GIBCO公司产品，小牛血清为浙江天航生物有限公司产品。其它化学试剂均为分析纯。
1.1.3 主要仪器设备
纯水仪，滤器，酶标仪，凝胶成像系统，落地式低温高速离心机，二氧化碳恒温培养箱，PCR仪，高速台式离心机，恒温空气浴摇床，旋涡震荡器，双人单面超净工作台，高速台式低温高速离心机，倒置荧光显微镜，超声波破碎仪，电子天平，垂直板电泳系统，倒置显微镜，NanoDrop2000超微量分光光度计。
1.2 成熟CaIFNα4基因的获得
据Genbank中已发表的犬干扰素α4（CaIFNα4）的序列（Genbank序列号：AB102731），首先全基因序列是由武汉金开瑞生物工程有限公司得到的针对大肠杆菌碱基偏好性优化后的犬干扰素α4，全基因序列如下：
ATGGCACTGCCGTGTAGCTTTAGCGTTGCACTGGTTCTGCTGAGCTGTCATAGCCTGTGTTGTCTGGCATGTGATCTGCCGGATACCCATAGCCTGCGTAATTGGCGTGTTCTGACCCTGCTGGGCCAGATGCGTCGTCTGAGCGCAAGCAGCTGTGATCATTATACCACCGATTTTGCATTTCCGAAAGAACTGTTTGATGGTCAGCGTCTGCAAGAAGCACAGGCACTGAGCGTTGTTCATGTTATGACCCAGAAAGTTTTTCACCTGTTTTGCACCAATATGAGCAGCGCACCGTGGAATATGACACTGCTGGAAGAACTGTGTAGCGGTCTGAGTGAACAGCTGGATGATCTGGATGCATGTCCGCTGCAAGAGGCAGGTCTGGCAGAAACACCGCTGATGCATGAAGATAGCACCCTGCGTACCTATTTTCAGCGTATTAGCCTGTATCTGCAGGATCGTAATCATAGCCCGTGTGCATGGGAAATGGTTCGTGCAGAAATTGGTCGTAGCTTTTTTAGCCTGACCATCCTGCAAGAACGTGTTCGTCGTCGTAAATAA
以上述基因为模板设计一对引物，上游引物加入酶切位点EcoR Ⅰ，下游引物加上酶切位点Sal Ⅰ，上游：F：5′TAGAATTCAACATGTGTGATCTGCCGGATACCC3′(EcoR Ⅰ)，下游：R：5′GTCGACTCATTTACGACGACGAACA3′（Sal Ⅰ）。扩增该目的基因，降落PCR扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s；5260℃ 30 s；72℃ 1 min；35个循环，72℃ 10 min。预计扩增的目的基因片段的大小为512 bp。
将PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，再使用凝胶回收纯化试剂盒回收PCR产物中目的片段，回收产物的操作如下：确定目标条带的位置并切下，将切下的凝胶块加入3倍凝胶体积量的GSB，60℃融化凝胶，注意液体受热均匀，待完全溶解后，加入10 μL浓度为3 M的醋酸钠溶液直至溶液变成黄色，可适量加入异丙醇，降至室温后，将其加入核酸纯化柱中，12000 r/min，离心1 min，弃流出液。加700 μL 洗脱液，12000 r/min，室温离心30 s，弃流出液。洗两遍，弃掉离心液后，装回柱子，12000 r/min，空离2 min，开盖2 min，挥发掉残余乙醇。将柱子放入新的EP管中，在核酸纯化柱的膜中央加入50 μL 的Elution Buffer，37℃温箱放置2 min后，12000 r/min离心1 min洗脱回收DNA。
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