姜黄素对免疫应激断奶仔猪肝脏抗氧化性能的影响
本试验旨在研究姜黄素对免疫应激断奶仔猪肝脏抗氧化功能的影响。选取体重相近28日龄的24头断奶仔猪，随机分为3组，分别为(1)N组基础日粮；(2)NL组基础日粮+LPS；(3)CL组基础日粮+200 mg/kg姜黄素+LPS，每组8个重复，每个重复1头仔猪。采集肝脏样品，观察分析结构形态、抗氧化酶活、抗氧化和热休克蛋白基因的表达。结果表明LPS可导致肝脏结构形态的损伤；与对照组相比，LPS可显著增加MDA含量(P<0.05)，降低CAT mRNA和SOD1 mRNA表达量(P<0.05)，增加HSP27(P<0.05)，HSP70和HSP90 (P>0.05)mRNA的表达；与NL组相比，CL组提高SOD酶和CAT酶活力，降低MDA含量，但差异不显著。与NL组相比，CL组对抗氧化基因表达没有影响，但降低热休克蛋白基因的表达。总之，姜黄素对LPS导致的免疫应激具有一定的缓解作用。关键字姜黄素；断奶仔猪；免疫应激；肝脏；抗氧化Effects of curcumin on liver antioxidant ability in weaned piglets suffered immune challengeStudent majoring in animal science Zhong Xiaoqun Tutor Zhong XiangAbstract: The present study was designed to study the effects of curcumin on liver antioxidant ability in weaned piglets suffered immune challenge. 24 weaned pigs with similar weight at 28 days of age were randomly divided into three groups: (1) N group: basic diet; (2) NL group: basic diet + LPS; (3) CL group: basic diet +200 mg / kg curcumin + LPS, Each groups had 8 repeats of 1piglet per repea *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
t. Liver samples collected, and the morphology, antioxidant activity, anti-oxidation, and the expression of heat shock protein gene were observed and analyzed. The results showed that: LPS caused liver morphology damage; compared to the control group, LPS can significantly increase MDA content (P <0.05), reduce the CAT mRNA and SOD1 mRNA expression (P <0.05), increased HSP27 (P <0.05 ), the expression of HSP70 and HSP90 (P> 0.05) mRNA; and compared with the NL group, the SOD and CAT enzyme activity of CL group were increased, the MDA content reduced, but the difference was not significant. Compared with the NL group, antioxidant gene expression was not affected in CL group, but the expression of heat shock protein gene was decreased. In short, Curcumin can alleviate immune challenge induced by LPS in weaned piglet.细菌脂多糖（LPS）是导致革兰氏阴性菌的重要因素，它广泛存在于畜禽的生存环境中，当畜禽感染后可以立即引起全身难以控制的全身炎症反应综合征，表现为对多脏器不同程度的损伤，尤其是对内部器官如:肠道、肝脏、法氏囊、胸腺等的损伤较为明显，是导致畜禽死亡的主要原因之一[1]。断奶仔猪腹腔注射LPS可诱导断奶仔猪免疫应激，降低断奶仔猪的免疫功能和抗病能力，严重的话导致断奶仔猪腹泻、甚至死亡。而国内外大量研究表明，姜黄素具有抗菌、促进动物采食、提高生产性能以及抗氧化和增强机体免疫等生物学功能[2]。随着人们生活质量的飞速提高和环境意识的不断加强，姜黄素的应用也逐渐扩大，姜黄素除应用于食品添加剂、害虫防治、杀菌抗菌和防腐等外，目前还被研究应用于动物饲料添加剂抗生素的替代品。但是关于断奶仔猪这方面的研究十分缺乏，因此本试验将LPS 作为诱发因子，研究姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化性能的影响。1 材料与方法1.1试验材料 姜黄素，购买于广州科虎生物技术研究开发商中心；LPS，脂多糖，购买于美国Sigma 公司；试验日粮，由康乐农牧有限公司提供。1.2试验设计 试验在常州康乐农牧有限公司进行。仔猪在进入猪舍前对猪舍进行全面清扫消毒，试验前按照猪场常规管理程序进行驱虫与免疫防疫。选取24头体重相近、断奶日龄为28 d的“杜×长×大”三元杂交仔猪，公母各半。试验采用单因子随机化设计，即免疫应激处理（注射生理盐水或LPS）和日粮处理（添加0、200 mg/kg姜黄素）。将24头仔猪随机分为3组，每组8个重复，每个重复1头仔猪，3个组分别为（1）N组对照组，饲喂基础日粮（2）NL组基础日粮+LPS（3）CL组基础日粮+200 mg/kg姜黄素+LPS。试验第18、28天清晨，对NL、CL组腹腔注射100 μg/kg BW LPS（空腹注射），N组注射等量的生理盐水。1.3饲养管理采用自动乳头式饮水器供水，猪只自由饮水。粉料饲喂，自由采食，每天饲喂4次（7:30，11:30，15:00，19:00），少量勤添，每次饲喂量以采食后食槽内略有剩余为度。每天详细记录仔猪采食量及腹泻情况等。正式试验期间温度保持在25-28 ℃，相对湿度维持在55%-80%之间。保持圈舍内空气流通和清洁，定期进行常规消毒。试验期共28天。1.4 样品采集在最后一次注射LPS24小时后，将仔猪颈放血处死，迅速打开腹腔，取出肝脏。1.5 制备10%的肝脏组织匀浆称取肝脏组织约0.3 g，按组织重（g）:体积（ml）=1:9加入0.86%的生理盐水（4℃预冷），用匀浆机处理（冰水浴中操作）至无颗粒的均一液体状态后4 ℃ 4000 rpm/min离心10分钟，吸取上清，-20 ℃保存待测。1.6测定指标与方法1.6.1肝脏抗氧化能力测定 采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定各管肝脏样品中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛（MDA）含量。1.6.2 荧光定量PCR1.6.2.1 RNA提取切取约30-100 mg组织，放入研钵，立即加入液氮研磨成细粉末，倒入离心管中，加入1 mL的Trizol溶液（4 ℃预冷）、0.2 mL氯仿（4℃预冷）旋涡振荡器充分混匀至均一液体状态，4 ℃静置5 min。4 ℃ 14000 rpm/min离心10 min（液体分为三层无色上清、白色蛋白质和有色有机层）。吸取400 μL上清液移入新的离心管中。加入400 μL异丙醇（-20℃预冷），旋涡振荡器充分混匀，-20 ℃静置20 min。4 ℃ 14000 rpm/min离心10 min，弃上清液，加入1 mL 75%乙醇（4℃预冷），轻轻上下颠倒清洗，4℃ 12000 rpm离心5 min，弃乙醇（如此反复清洗2次），最后通风5-10 min使乙醇挥发，即得到透明的RNA沉淀。根据RNA团块的大小，加入20-50 μL的DEPC水溶解RNA后检验、测定RNA纯度与浓度并稀释至同一浓度（500 ng/nL）1.6.2.2 反转录 反转录按照PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒以20 μL的体系进行。反转录程序37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s。反转录得到的cDNA用超纯水5倍稀释后-80℃冻存待测。1.6.2.3 实时定量PCR步骤荧光定量PCR。按照Takara SYBR? Premix Ex Taq?定量试剂盒说明书，依次往定量PCR管加入下列试剂（20 μL体系）dH2O 6.8 μL、上下游引物各0.4 μL、模板2 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL、SYBR Premix Ex Taq 10 μL，混匀离心后在Real-time PCR仪上反应检测，反应程序95 ℃，30 s；(95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；重复40个循环)；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。检测每个目的基因mRNA 表达量。以内参基因校正结果，利用2-△△Ct法对基因表达进行相对定量。各目的基因引物序列见表1。表1 PCR引物序列引物名称引物序列SOD1上游AGGGAGAGAAGACAGTGTTAGT下游GTACACAGTGGCCACACCATCAT上游TGTACCCGCTATTCTGGGGA下游TCACACAGGCGTTTCCTCTCGPX1上游CCTCAAGTACGTCCGACCAG下游GTGAGCATTTGCGCCATTCAHSP27上游AAGCTGGAAAGTCGGAAAAGC下游AAAGAGCACAGAGAGTTGGCAGHSP70上游CGCAGGTGTCTTTGAGGTGA下游CTTCCTGTGCTTCCGTCGAAHSP90上游GATCACTTGGCTGTGAAGCA下游AGAGTCCACCACGCCTCTAAβ-actin上游CACGCCATCCTGCGTCTGGA下游AGCACCGTGTTGGCGTAGAG1.6.3 肝脏形态学观察样品在4%多聚甲醛中固定24小时后，换为75%乙醇固定。然后进行脱水、透明、浸蜡、包埋、HE染色、脱水、透明及封片，在光学显微镜下进行肝脏形态学观察。1.7数据处理与统计试验数据用Exce2007初步整理后，采用SPSS统计软件One-Way an ANOVA 进行方差分析和多重比较。以P<0.05(差异显著)作为差异显著性判断标准。2 结果分析2.1姜黄素对断奶仔猪肝脏形态学的影响图1所示是用HE染色法在40倍光镜下观察断奶仔猪肝脏组织形态学变化的情况。正常的N组肝脏组织肝小叶结构完整，肝索排列成放射状，肝细胞结构完整(图1A)；断奶仔猪腹腔注射LPS的NL组肝脏组织结构混乱，窦隙间隔变宽，肝细胞肿大特别明显，细胞质内有许多小的空泡（图1B）,表明LPS导致断奶仔猪肝脏损伤比较严重；日粮中添加姜黄素的CL组肝脏组织结构不太清晰完整，窦隙有点变宽，肝细胞有点肿大，但是不太明显（图1C）,表明姜黄素可以减弱LPS导致的肝脏损伤。 A B C N组（HE，×40） NL（HE，×40） CL（HE，×40） 图1 肝脏切片2.2姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化性能的影响从表2可知，断奶仔猪腹腔注射LPS显著提高了断奶仔猪肝脏中SOD酶活力(P<0.05)，NL组比N组提高了18.12%；断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素也显著提高了断奶仔猪肝脏中SOD酶活力(P<0.05)，CL组比N组提高了19.68%；断奶仔猪腹腔注射LPS和断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素相比，断奶仔猪肝脏中SOD 酶活力差异不显著(P>0.05)，CL组比NL组提高了1.32%。断奶仔猪腹腔注射LPS和断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素与对照组之间相比，断奶仔猪肝脏中CAT酶活力差异不显著(P>0.05)，NL组比N组降低了4.72%，CL组比N组降低了2.19%，CL组比NL组提高了2.66%。断奶仔猪腹腔注射LPS显著增加了断奶仔猪肝脏中MDA含量(P<0.05)，NL组比N组提高了53.49%；断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素与对照组相比，断奶仔猪肝脏中MDA含量差异不显著(P>0.05)，CL组比N组提高了20.93%；断奶仔猪腹腔注射LPS和断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素相比，断奶仔猪肝脏中MDA含量差异不显著(P>0.05)，CL组比NL组降低了21.21%。表2 姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化性能的影响项目 N组 NL组 CL组SOD（U/mg protein)169.79±7.67b200.55±4.37a203.20±8.55aCAT（U/mg protein)78.12±6.8874.43±13.1776.41±7.05MDA（nmol/mg protein)0.43±0.21b0.66±0.11a0.52±0.40ab同行无字母或数据肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)2.3姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化基因表达量的影响从表3可知，断奶仔猪腹腔注射LPS显著降低了断奶仔猪肝脏中CAT mRAN表达量(P<0.05)，NL组比N组降低了85.12%；断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素也显著降低了断奶仔猪肝脏中CAT mRAN表达量(P<0.05)，CL组比N组降低了84.86%；断奶仔猪腹腔注射LPS和断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素相比，断奶仔猪肝脏中CAT mRAN表达量差异不显著(P>0.05)，CL组比NL组提高了1.75%。断奶仔猪腹腔注射LPS显著降低了断奶仔猪肝脏中SOD1 mRAN表达量(P<0.05)，NL组比N组降低了68.04%；断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素也显著降低了断奶仔猪肝脏中SOD1 mRAN表达量(P<0.05)，CL组比N组降低了68.38%；断奶仔猪腹腔注射LPS和断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素相比，断奶仔猪肝脏中SOD1 mRAN表达量差异不显著(P>0.05)，CL组比NL组降低了1.08%。断奶仔猪腹腔注射LPS和断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素与对照组之间相比，断奶仔猪肝脏中GPX1 mRAN表达量差异不显著(P>0.05)，NL组比N组提高了1.83%，CL组比N组降低了14.68%，CL组比NL组降低了16.22%。表3 姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化基因的影响项目 N组 NL组 CL组CAT3.83±1.12a0.57±0.10b0.58±0.15bSOD12.91±0.62a0.93±0.12b0.92±0.28bGPX11.09±0.221.11±0.190.93±0.11同行无字母或数据肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)2.4姜黄素对断奶仔猪肝脏热休克蛋白基因表达的影响从表4可知，断奶仔猪腹腔注射LPS显著增加了断奶仔猪肝脏中HSP27基因表达量(P<0.05)，NL组比N组增加了164.71%；断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素也显著增加了断奶仔猪肝脏中HSP27基因表达量(P<0.05)，CL组比N组增加了58.82%；断奶仔猪腹腔注射LPS和断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素相比，断奶仔猪肝脏中HSP27基因表达量差异不显著(P>0.05)，CL组比NL组减少了40.00%。断奶仔猪腹腔注射LPS和断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素与对照组之间相比，断奶仔猪肝脏中HSP70基因表达量差异不显著(P>0.05)，CL组比NL组减少了9.09%。断奶仔猪腹腔注射LPS和断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素与对照组之间相比，断奶仔猪肝脏中HSP90基因表达量差异也不显著(P>0.05)，CL组比NL组减少了15.38%。表4 姜黄素对热休蛋白克基因的影响项目 N组 NL组 CL组HSP270.017±0.0021b0.045±0.014a0.027±0.0071aHSP700.00040±0.00076e20.066±0.0350.060±0.030HSP900.53±0.0762.21±0.601.87±0.69同行无字母或数据肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)3 讨论引起机体氧化损伤的机制主要有两种一种是向机体“注入”自由基或其前体物质来直接增加机体自由基；另一种是破坏抗氧化系统中的酶系或非酶系来降低机体抗氧化能力。王艳萍等[3]研究表明一定量的LPS 能诱发动物体内产生氧自由基，降低机体的抗氧化能力。而姜黄素是一种具有很多种生物学功能的天然的绿色抗氧化剂，包括抗炎症、抗癌症和降血脂等[4]。研究认为，姜黄素的多种药理学活性与其突出的抗氧化功效紧密相关[5]。姜黄素的抗氧化活性主要包括两个方面:一是姜黄素作为自由基清除剂，直接与环境中多余的自由基发生中和反应;二是姜黄素作为细胞内抗氧化信号通路的诱导剂，通过增强抗氧化酶活和二项代谢酶的活性，提高细胞的抗氧化防御能力[6]。3.1姜黄素对断奶仔猪肝脏形态学的影响研究发现[7]，姜黄素可以防止肝脏细胞脂肪变性，对肝脏损伤具有一定的保护作用。本实验中，对照组断奶仔猪肝脏组织结构完整、清晰，肝小叶结构正常，肝细胞无脂肪变性等异常改变。断奶仔猪腹腔注射LPS与断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素均导致断奶仔猪肝细胞不同程度的脂肪变性。断奶仔猪腹腔注射LPS导致断奶仔猪肝细胞脂肪变性最重，表现为肝小叶界限不清，肝细胞索排列紊乱，多数肝窦消失，大部分肝细胞出现严重的脂肪变性，以小叶中央静脉周围最为严重，肝细胞极度肿胀呈圆形，胞浆内可以看见大小各异、数量不同的脂滴空泡（脂肪变性），严重者脂滴相互融合，将细胞核挤向一侧，类似脂肪细胞[8-10]。断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素与断奶仔猪腹腔注射LPS对比，日粮中添加姜黄素能够减轻断奶仔猪肝细胞脂肪变性，但是差异不显著。3.2 姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化性能的影响机体抗氧化防御体系主要包括SOD、CAT和MDA等，担负着机体抗氧化的主要作用。SOD是生物体内重要的金属酶，能够催化超氧化物自由基歧化为O2和H2O，能够保护机体的氧化平衡。CAT存在于红细胞及某些组织内的过氧化体中，它的主要作用是催化H2O2分解为H2O与O2，使得H2O2不会与O2在铁螯合物作用下反应生成极有害的-OH。体内抗氧化酶的活性代表了体内抗氧化状态。MDA是脂质过氧化反应的产物，其水平的高低可间接反映体内氧自由基生成与清除是否处于平衡状态[11-13]。有研究发现[14]，姜黄素还可提高超氧化物歧化酶活性，有效清除超氧化物，抑制动物组织丙二醛的产生，从而对动物机体损伤具有保护作用。 在本试验中，LPS导致的免疫应激能够显著提高断奶仔猪肝脏中SOD酶活力和增加肝脏中MDA含量。LPS导致的免疫应激也能够降低断奶仔猪肝脏中CAT酶活力，但是差异不显著。断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素能够显著提高断奶仔猪肝脏中SOD酶活力。断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素也能够减弱断奶仔猪肝脏中CAT酶活力和增加肝脏中MDA含量，但是差异不显著。断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素与断奶仔猪腹腔注射LPS对比，日粮中添加姜黄素能够提高断奶仔猪肝脏中SOD酶、CAT酶活力和降低断奶仔猪肝脏中MDA含量，但是差异不显著。提示日粮中添加姜黄素可以缓解LPS导致的免疫应激对断奶仔猪肝脏抗氧化性能的损伤。3.3姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化基因表达量的影响有实验结果表明，姜黄素的抗氧化活性主要通过促进SOD1、CAT、CPX1等酶的合成来实现[15]。SOD1是一种细胞内过氧化物歧化酶，其含量可反映机体的抗氧化状态。CAT是一种酶类清除剂，清除体内的过氧化氢，从而使细胞不会受到H2O2的毒害，是生物防御系统的关键酶之一[16-18]。本试验的结果表明，LPS导致的免疫应激能够显著降低了断奶仔猪肝脏中SOD1 mRNA和CAT mRNA表达量。断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素也能够显著降低了断奶仔猪肝脏中SOD1 mRNA和CAT mRNA表达量。GPX1是一种细胞内谷胱甘肽过氧化物酶，保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物酶的干扰及损害[19-22]。本试验的结果表明，LPS导致的免疫应激能够增加断奶仔猪肝脏中GPX1 mRNA表达量，但是差异不显著。断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素能够降低断奶仔猪肝脏中GPX1 mRNA表达量，但是差异也不显著。断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素与断奶仔猪腹腔注射LPS对比，日粮中添加姜黄素能够降低断奶仔猪肝脏中SOD1 mRNA、GPX1 mRNA表达量和增加断奶仔猪肝脏中CAT mRNA表达量，但是差异不显著。3.4姜黄素对断奶仔猪肝脏热休克蛋白基因表达的影响热休克蛋白是一种保护性蛋白，是生物体内最古老的分子之一，受到高温等恶劣环境刺激时，就会被大量合成（正常情况下也有少许存在），来帮助每个细胞维持正常的生理活动，促进有利于细胞健康的相互作用，阻止影响细胞健康的蛋白质相互作用[23-25]。按照蛋白的大小，热休克蛋白可以分为很多类，包括HSP27、HSP70、HSP90等。有实验结果结果表明[26]，姜黄素可以抑制HSP27 mRNA、HSP70 mRNA和HSP90 mRNA的表达量，且随着剂量的增加，抑制效果越明显。在本试验中，LPS导致的免疫应激能够显著增加断奶仔猪肝脏HSP27 mRNA表达量。断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素也能够显著增加了断奶仔猪肝脏中HSP27 mRNA表达量。LPS导致的免疫应激能够增加断奶仔猪肝脏HSP70 mRNA和HSP90 mRNA表达量，但是差异不显著。断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素也能够也增加了断奶仔猪肝脏中HSP70 mRNA和HSP90 mRNA表达量，但是差异不显著。断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素与断奶仔猪腹腔注射LPS对比，CL组的HSP27 mRNA、HSP70 mRNA和HSP90 mRNA低于NL组，但是差异不显著。表明姜黄素具有缓解免疫应激的作用，因为HSP27 mRNA、HSP70 mRNA和HSP90 mRNA的表达水平能在一定程度上反映仔猪肝脏应激的情况，表达水平越高，应激或者肝脏受到的损伤就越严重。4 结论LPS能够导致断奶仔猪发生氧化应激，降低机体的抗氧化能力。日粮中添加姜黄素减轻了LPS对断奶仔猪氧化应激引起的肝脏结构形态的损伤，降低断奶仔猪肝脏中MDA含量，同时降低断奶仔猪肝脏中热休克蛋白的表达量。总之，日粮中添加姜黄素对LPS导致的氧化应激具有一定的缓冲作用，但具体的作用机制还需要进一步的探索。致谢本毕业论文是在钟翔副教授的悉心指导下完成的，在此我谨向我的导师致以最崇高的敬意和衷心的感谢！感谢实验室余嘉瑶师姐和应志雄师兄在试验进行过程中的指导！芦娜师姐在本试验的选题、设计、实施及论文的撰写和修改方面给予了极大的帮助，感谢她的耐心与包容，祝她一帆风顺。同时，感谢实验室各位师哥师姐的援手与指导，他们的支持不断给予我信心和不懈努力的动力，让我在实验室里感受到家的温暖。另外，赞美我的两位同窗，不辞辛苦地陪伴着我。参考文献涂健，王艳萍，彭开松，等.内毒素诱发鸡多脏器损伤及其对肝TLR4mRNA 表达影响［J］.生物学杂志，2007，613-15.鲍华英，陈荣华.姜黄素的研究进展[J]. 国外医学儿科学分册，2003,30（5）:254－256.王艳萍，祁克宗，涂健，等.内毒素对仔鸡血浆SOD 活性及MDA 水平的影响［J］.动物医学进展，2006，563-65.糖传核，彭志英.姜黄素类物质的生理功能以及其抗氧化机制[J].中国食品添加剂，2000(4):40－44.陈巍峰. 姜黄素及其类似物的抗氧化活性研究[D]. 兰州: 兰州大学,2006.王恬，张婧菲.姜黄素的理化特性、抗氧化功能及其在肉鸡生产中的应用[N].动物营养学报，2014，26（10）3101-3107.Rukkumani R，Sri Balasubashini M，Vishwanathan P，et a1．Comparative effects of curcumin and photo-imidiated curcumin on alcoho1-and polyunsaturated fatty acid-induced hyperlipidemia[J]．Pharmscol Res，2002，46(3)257-64赵珍东.姜黄素抗肝纤维化作用及机理研究[J]. 中国实验方剂学杂志，2010; 16( 3) : 122-125.狄建彬,顾振纶,赵笑东,等. 姜黄素防治大鼠高脂性脂肪肝的研究[J]. 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目录
摘要 1
关键字 1
ABSTRACT 1
KEYWORDS 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1试验材料 2
1.2试验设计 2
1.3饲养管理 2
1.4 样品采集 2
1.5 制备10%的肝脏组织匀浆 2
1.6测定指标与方法 2
1.6.1肝脏抗氧化能力测定 2
1.6.2 荧光定量PCR 2
1.6.2.1 RNA提取 2
1.6.2.2 反转录 3
1.6.2.3 实时定量PCR步骤 3
1.7数据处理与统计 3
2 结果分析 3
2.1姜黄素对断奶仔猪肝脏形态学的影响 3
2.2姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化性能的影响 4
2.3姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化基因表达量的影响 4
2.4姜黄素对断奶仔猪肝脏热休克蛋白基因表达的影响 5
3 讨论 5
3.1姜黄素对断奶仔猪肝脏形态学的影响 5
3.2 姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化性能的影响 5
3.3姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化基因表达量的影响 6
3.4姜黄素对断奶仔猪肝脏热休克蛋白基因表达的影响 6
4 结论 7
致谢 7
参考文献： 7
姜黄素对免疫应激断奶仔猪肝脏抗氧化性能的影响
引言
引言
t. Liver samples collected, and the morphology, antioxidant activity, anti-oxidation, and the expression of heat shock protein gene were observed and analyzed. The results showed that: LPS caused liver morphology damage; compared to the control group, LPS can significantly increase MDA content (P <0.05), reduce the CAT mRNA and SOD1 mRNA expression (P <0.05), increased HSP27 (P <0.05 ), the expression of HSP70 and HSP90 (P> 0.05) mRNA; and compared with the NL group, the SOD and CAT enzyme activity of CL group were increased, the MDA content reduced, but the difference was not significant. Compared with the NL group, antioxidant gene expression was not affected in CL group, but the expression of heat shock protein gene was decreased. In short, Curcumin can alleviate immune challenge induced by LPS in weaned piglet.细菌脂多糖（LPS）是导致革兰氏阴性菌的重要因素，它广泛存在于畜禽的生存环境中，当畜禽感染后可以立即引起全身难以控制的全身炎症反应综合征，表现为对多脏器不同程度的损伤，尤其是对内部器官如:肠道、肝脏、法氏囊、胸腺等的损伤较为明显，是导致畜禽死亡的主要原因之一[1]。断奶仔猪腹腔注射LPS可诱导断奶仔猪免疫应激，降低断奶仔猪的免疫功能和抗病能力，严重的话导致断奶仔猪腹泻、甚至死亡。而国内外大量研究表明，姜黄素具有抗菌、促进动物采食、提高生产性能以及抗氧化和增强机体免疫等生物学功能[2]。随着人们生活质量的飞速提高和环境意识的不断加强，姜黄素的应用也逐渐扩大，姜黄素除应用于食品添加剂、害虫防治、杀菌抗菌和防腐等外，目前还被研究应用于动物饲料添加剂抗生素的替代品。但是关于断奶仔猪这方面的研究十分缺乏，因此本试验将LPS 作为诱发因子，研究姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化性能的影响。1 材料与方法1.1试验材料 姜黄素，购买于广州科虎生物技术研究开发商中心；LPS，脂多糖，购买于美国Sigma 公司；试验日粮，由康乐农牧有限公司提供。1.2试验设计 试验在常州康乐农牧有限公司进行。仔猪在进入猪舍前对猪舍进行全面清扫消毒，试验前按照猪场常规管理程序进行驱虫与免疫防疫。选取24头体重相近、断奶日龄为28 d的“杜×长×大”三元杂交仔猪，公母各半。试验采用单因子随机化设计，即免疫应激处理（注射生理盐水或LPS）和日粮处理（添加0、200 mg/kg姜黄素）。将24头仔猪随机分为3组，每组8个重复，每个重复1头仔猪，3个组分别为（1）N组对照组，饲喂基础日粮（2）NL组基础日粮+LPS（3）CL组基础日粮+200 mg/kg姜黄素+LPS。试验第18、28天清晨，对NL、CL组腹腔注射100 μg/kg BW LPS（空腹注射），N组注射等量的生理盐水。1.3饲养管理采用自动乳头式饮水器供水，猪只自由饮水。粉料饲喂，自由采食，每天饲喂4次（7:30，11:30，15:00，19:00），少量勤添，每次饲喂量以采食后食槽内略有剩余为度。每天详细记录仔猪采食量及腹泻情况等。正式试验期间温度保持在25-28 ℃，相对湿度维持在55%-80%之间。保持圈舍内空气流通和清洁，定期进行常规消毒。试验期共28天。1.4 样品采集在最后一次注射LPS24小时后，将仔猪颈放血处死，迅速打开腹腔，取出肝脏。1.5 制备10%的肝脏组织匀浆称取肝脏组织约0.3 g，按组织重（g）:体积（ml）=1:9加入0.86%的生理盐水（4℃预冷），用匀浆机处理（冰水浴中操作）至无颗粒的均一液体状态后4 ℃ 4000 rpm/min离心10分钟，吸取上清，-20 ℃保存待测。1.6测定指标与方法1.6.1肝脏抗氧化能力测定 采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定各管肝脏样品中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶(CAT)活性及丙二醛（MDA）含量。1.6.2 荧光定量PCR1.6.2.1 RNA提取切取约30-100 mg组织，放入研钵，立即加入液氮研磨成细粉末，倒入离心管中，加入1 mL的Trizol溶液（4 ℃预冷）、0.2 mL氯仿（4℃预冷）旋涡振荡器充分混匀至均一液体状态，4 ℃静置5 min。4 ℃ 14000 rpm/min离心10 min（液体分为三层无色上清、白色蛋白质和有色有机层）。吸取400 μL上清液移入新的离心管中。加入400 μL异丙醇（-20℃预冷），旋涡振荡器充分混匀，-20 ℃静置20 min。4 ℃ 14000 rpm/min离心10 min，弃上清液，加入1 mL 75%乙醇（4℃预冷），轻轻上下颠倒清洗，4℃ 12000 rpm离心5 min，弃乙醇（如此反复清洗2次），最后通风5-10 min使乙醇挥发，即得到透明的RNA沉淀。根据RNA团块的大小，加入20-50 μL的DEPC水溶解RNA后检验、测定RNA纯度与浓度并稀释至同一浓度（500 ng/nL）1.6.2.2 反转录 反转录按照PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)试剂盒以20 μL的体系进行。反转录程序37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s。反转录得到的cDNA用超纯水5倍稀释后-80℃冻存待测。1.6.2.3 实时定量PCR步骤荧光定量PCR。按照Takara SYBR? Premix Ex Taq?定量试剂盒说明书，依次往定量PCR管加入下列试剂（20 μL体系）dH2O 6.8 μL、上下游引物各0.4 μL、模板2 μL、ROX Reference Dye 0.4 μL、SYBR Premix Ex Taq 10 μL，混匀离心后在Real-time PCR仪上反应检测，反应程序95 ℃，30 s；(95 ℃，5 s；60 ℃，30 s；重复40个循环)；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。检测每个目的基因mRNA 表达量。以内参基因校正结果，利用2-△△Ct法对基因表达进行相对定量。各目的基因引物序列见表1。表1 PCR引物序列引物名称引物序列SOD1上游AGGGAGAGAAGACAGTGTTAGT下游GTACACAGTGGCCACACCATCAT上游TGTACCCGCTATTCTGGGGA下游TCACACAGGCGTTTCCTCTCGPX1上游CCTCAAGTACGTCCGACCAG下游GTGAGCATTTGCGCCATTCAHSP27上游AAGCTGGAAAGTCGGAAAAGC下游AAAGAGCACAGAGAGTTGGCAGHSP70上游CGCAGGTGTCTTTGAGGTGA下游CTTCCTGTGCTTCCGTCGAAHSP90上游GATCACTTGGCTGTGAAGCA下游AGAGTCCACCACGCCTCTAAβ-actin上游CACGCCATCCTGCGTCTGGA下游AGCACCGTGTTGGCGTAGAG1.6.3 肝脏形态学观察样品在4%多聚甲醛中固定24小时后，换为75%乙醇固定。然后进行脱水、透明、浸蜡、包埋、HE染色、脱水、透明及封片，在光学显微镜下进行肝脏形态学观察。1.7数据处理与统计试验数据用Exce2007初步整理后，采用SPSS统计软件One-Way an ANOVA 进行方差分析和多重比较。以P<0.05(差异显著)作为差异显著性判断标准。2 结果分析2.1姜黄素对断奶仔猪肝脏形态学的影响图1所示是用HE染色法在40倍光镜下观察断奶仔猪肝脏组织形态学变化的情况。正常的N组肝脏组织肝小叶结构完整，肝索排列成放射状，肝细胞结构完整(图1A)；断奶仔猪腹腔注射LPS的NL组肝脏组织结构混乱，窦隙间隔变宽，肝细胞肿大特别明显，细胞质内有许多小的空泡（图1B）,表明LPS导致断奶仔猪肝脏损伤比较严重；日粮中添加姜黄素的CL组肝脏组织结构不太清晰完整，窦隙有点变宽，肝细胞有点肿大，但是不太明显（图1C）,表明姜黄素可以减弱LPS导致的肝脏损伤。 A B C N组（HE，×40） NL（HE，×40） CL（HE，×40） 图1 肝脏切片2.2姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化性能的影响从表2可知，断奶仔猪腹腔注射LPS显著提高了断奶仔猪肝脏中SOD酶活力(P<0.05)，NL组比N组提高了18.12%；断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素也显著提高了断奶仔猪肝脏中SOD酶活力(P<0.05)，CL组比N组提高了19.68%；断奶仔猪腹腔注射LPS和断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素相比，断奶仔猪肝脏中SOD 酶活力差异不显著(P>0.05)，CL组比NL组提高了1.32%。断奶仔猪腹腔注射LPS和断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素与对照组之间相比，断奶仔猪肝脏中CAT酶活力差异不显著(P>0.05)，NL组比N组降低了4.72%，CL组比N组降低了2.19%，CL组比NL组提高了2.66%。断奶仔猪腹腔注射LPS显著增加了断奶仔猪肝脏中MDA含量(P<0.05)，NL组比N组提高了53.49%；断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素与对照组相比，断奶仔猪肝脏中MDA含量差异不显著(P>0.05)，CL组比N组提高了20.93%；断奶仔猪腹腔注射LPS和断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素相比，断奶仔猪肝脏中MDA含量差异不显著(P>0.05)，CL组比NL组降低了21.21%。表2 姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化性能的影响项目 N组 NL组 CL组SOD（U/mg protein)169.79±7.67b200.55±4.37a203.20±8.55aCAT（U/mg protein)78.12±6.8874.43±13.1776.41±7.05MDA（nmol/mg protein)0.43±0.21b0.66±0.11a0.52±0.40ab同行无字母或数据肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)2.3姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化基因表达量的影响从表3可知，断奶仔猪腹腔注射LPS显著降低了断奶仔猪肝脏中CAT mRAN表达量(P<0.05)，NL组比N组降低了85.12%；断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素也显著降低了断奶仔猪肝脏中CAT mRAN表达量(P<0.05)，CL组比N组降低了84.86%；断奶仔猪腹腔注射LPS和断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素相比，断奶仔猪肝脏中CAT mRAN表达量差异不显著(P>0.05)，CL组比NL组提高了1.75%。断奶仔猪腹腔注射LPS显著降低了断奶仔猪肝脏中SOD1 mRAN表达量(P<0.05)，NL组比N组降低了68.04%；断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素也显著降低了断奶仔猪肝脏中SOD1 mRAN表达量(P<0.05)，CL组比N组降低了68.38%；断奶仔猪腹腔注射LPS和断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素相比，断奶仔猪肝脏中SOD1 mRAN表达量差异不显著(P>0.05)，CL组比NL组降低了1.08%。断奶仔猪腹腔注射LPS和断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素与对照组之间相比，断奶仔猪肝脏中GPX1 mRAN表达量差异不显著(P>0.05)，NL组比N组提高了1.83%，CL组比N组降低了14.68%，CL组比NL组降低了16.22%。表3 姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化基因的影响项目 N组 NL组 CL组CAT3.83±1.12a0.57±0.10b0.58±0.15bSOD12.91±0.62a0.93±0.12b0.92±0.28bGPX11.09±0.221.11±0.190.93±0.11同行无字母或数据肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)2.4姜黄素对断奶仔猪肝脏热休克蛋白基因表达的影响从表4可知，断奶仔猪腹腔注射LPS显著增加了断奶仔猪肝脏中HSP27基因表达量(P<0.05)，NL组比N组增加了164.71%；断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素也显著增加了断奶仔猪肝脏中HSP27基因表达量(P<0.05)，CL组比N组增加了58.82%；断奶仔猪腹腔注射LPS和断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素相比，断奶仔猪肝脏中HSP27基因表达量差异不显著(P>0.05)，CL组比NL组减少了40.00%。断奶仔猪腹腔注射LPS和断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素与对照组之间相比，断奶仔猪肝脏中HSP70基因表达量差异不显著(P>0.05)，CL组比NL组减少了9.09%。断奶仔猪腹腔注射LPS和断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素与对照组之间相比，断奶仔猪肝脏中HSP90基因表达量差异也不显著(P>0.05)，CL组比NL组减少了15.38%。表4 姜黄素对热休蛋白克基因的影响项目 N组 NL组 CL组HSP270.017±0.0021b0.045±0.014a0.027±0.0071aHSP700.00040±0.00076e20.066±0.0350.060±0.030HSP900.53±0.0762.21±0.601.87±0.69同行无字母或数据肩标相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)3 讨论引起机体氧化损伤的机制主要有两种一种是向机体“注入”自由基或其前体物质来直接增加机体自由基；另一种是破坏抗氧化系统中的酶系或非酶系来降低机体抗氧化能力。王艳萍等[3]研究表明一定量的LPS 能诱发动物体内产生氧自由基，降低机体的抗氧化能力。而姜黄素是一种具有很多种生物学功能的天然的绿色抗氧化剂，包括抗炎症、抗癌症和降血脂等[4]。研究认为，姜黄素的多种药理学活性与其突出的抗氧化功效紧密相关[5]。姜黄素的抗氧化活性主要包括两个方面:一是姜黄素作为自由基清除剂，直接与环境中多余的自由基发生中和反应;二是姜黄素作为细胞内抗氧化信号通路的诱导剂，通过增强抗氧化酶活和二项代谢酶的活性，提高细胞的抗氧化防御能力[6]。3.1姜黄素对断奶仔猪肝脏形态学的影响研究发现[7]，姜黄素可以防止肝脏细胞脂肪变性，对肝脏损伤具有一定的保护作用。本实验中，对照组断奶仔猪肝脏组织结构完整、清晰，肝小叶结构正常，肝细胞无脂肪变性等异常改变。断奶仔猪腹腔注射LPS与断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素均导致断奶仔猪肝细胞不同程度的脂肪变性。断奶仔猪腹腔注射LPS导致断奶仔猪肝细胞脂肪变性最重，表现为肝小叶界限不清，肝细胞索排列紊乱，多数肝窦消失，大部分肝细胞出现严重的脂肪变性，以小叶中央静脉周围最为严重，肝细胞极度肿胀呈圆形，胞浆内可以看见大小各异、数量不同的脂滴空泡（脂肪变性），严重者脂滴相互融合，将细胞核挤向一侧，类似脂肪细胞[8-10]。断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素与断奶仔猪腹腔注射LPS对比，日粮中添加姜黄素能够减轻断奶仔猪肝细胞脂肪变性，但是差异不显著。3.2 姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化性能的影响机体抗氧化防御体系主要包括SOD、CAT和MDA等，担负着机体抗氧化的主要作用。SOD是生物体内重要的金属酶，能够催化超氧化物自由基歧化为O2和H2O，能够保护机体的氧化平衡。CAT存在于红细胞及某些组织内的过氧化体中，它的主要作用是催化H2O2分解为H2O与O2，使得H2O2不会与O2在铁螯合物作用下反应生成极有害的-OH。体内抗氧化酶的活性代表了体内抗氧化状态。MDA是脂质过氧化反应的产物，其水平的高低可间接反映体内氧自由基生成与清除是否处于平衡状态[11-13]。有研究发现[14]，姜黄素还可提高超氧化物歧化酶活性，有效清除超氧化物，抑制动物组织丙二醛的产生，从而对动物机体损伤具有保护作用。 在本试验中，LPS导致的免疫应激能够显著提高断奶仔猪肝脏中SOD酶活力和增加肝脏中MDA含量。LPS导致的免疫应激也能够降低断奶仔猪肝脏中CAT酶活力，但是差异不显著。断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素能够显著提高断奶仔猪肝脏中SOD酶活力。断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素也能够减弱断奶仔猪肝脏中CAT酶活力和增加肝脏中MDA含量，但是差异不显著。断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素与断奶仔猪腹腔注射LPS对比，日粮中添加姜黄素能够提高断奶仔猪肝脏中SOD酶、CAT酶活力和降低断奶仔猪肝脏中MDA含量，但是差异不显著。提示日粮中添加姜黄素可以缓解LPS导致的免疫应激对断奶仔猪肝脏抗氧化性能的损伤。3.3姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化基因表达量的影响有实验结果表明，姜黄素的抗氧化活性主要通过促进SOD1、CAT、CPX1等酶的合成来实现[15]。SOD1是一种细胞内过氧化物歧化酶，其含量可反映机体的抗氧化状态。CAT是一种酶类清除剂，清除体内的过氧化氢，从而使细胞不会受到H2O2的毒害，是生物防御系统的关键酶之一[16-18]。本试验的结果表明，LPS导致的免疫应激能够显著降低了断奶仔猪肝脏中SOD1 mRNA和CAT mRNA表达量。断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素也能够显著降低了断奶仔猪肝脏中SOD1 mRNA和CAT mRNA表达量。GPX1是一种细胞内谷胱甘肽过氧化物酶，保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物酶的干扰及损害[19-22]。本试验的结果表明，LPS导致的免疫应激能够增加断奶仔猪肝脏中GPX1 mRNA表达量，但是差异不显著。断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素能够降低断奶仔猪肝脏中GPX1 mRNA表达量，但是差异也不显著。断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素与断奶仔猪腹腔注射LPS对比，日粮中添加姜黄素能够降低断奶仔猪肝脏中SOD1 mRNA、GPX1 mRNA表达量和增加断奶仔猪肝脏中CAT mRNA表达量，但是差异不显著。3.4姜黄素对断奶仔猪肝脏热休克蛋白基因表达的影响热休克蛋白是一种保护性蛋白，是生物体内最古老的分子之一，受到高温等恶劣环境刺激时，就会被大量合成（正常情况下也有少许存在），来帮助每个细胞维持正常的生理活动，促进有利于细胞健康的相互作用，阻止影响细胞健康的蛋白质相互作用[23-25]。按照蛋白的大小，热休克蛋白可以分为很多类，包括HSP27、HSP70、HSP90等。有实验结果结果表明[26]，姜黄素可以抑制HSP27 mRNA、HSP70 mRNA和HSP90 mRNA的表达量，且随着剂量的增加，抑制效果越明显。在本试验中，LPS导致的免疫应激能够显著增加断奶仔猪肝脏HSP27 mRNA表达量。断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素也能够显著增加了断奶仔猪肝脏中HSP27 mRNA表达量。LPS导致的免疫应激能够增加断奶仔猪肝脏HSP70 mRNA和HSP90 mRNA表达量，但是差异不显著。断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素也能够也增加了断奶仔猪肝脏中HSP70 mRNA和HSP90 mRNA表达量，但是差异不显著。断奶仔猪腹腔注射LPS同时日粮中添加姜黄素与断奶仔猪腹腔注射LPS对比，CL组的HSP27 mRNA、HSP70 mRNA和HSP90 mRNA低于NL组，但是差异不显著。表明姜黄素具有缓解免疫应激的作用，因为HSP27 mRNA、HSP70 mRNA和HSP90 mRNA的表达水平能在一定程度上反映仔猪肝脏应激的情况，表达水平越高，应激或者肝脏受到的损伤就越严重。4 结论LPS能够导致断奶仔猪发生氧化应激，降低机体的抗氧化能力。日粮中添加姜黄素减轻了LPS对断奶仔猪氧化应激引起的肝脏结构形态的损伤，降低断奶仔猪肝脏中MDA含量，同时降低断奶仔猪肝脏中热休克蛋白的表达量。总之，日粮中添加姜黄素对LPS导致的氧化应激具有一定的缓冲作用，但具体的作用机制还需要进一步的探索。致谢本毕业论文是在钟翔副教授的悉心指导下完成的，在此我谨向我的导师致以最崇高的敬意和衷心的感谢！感谢实验室余嘉瑶师姐和应志雄师兄在试验进行过程中的指导！芦娜师姐在本试验的选题、设计、实施及论文的撰写和修改方面给予了极大的帮助，感谢她的耐心与包容，祝她一帆风顺。同时，感谢实验室各位师哥师姐的援手与指导，他们的支持不断给予我信心和不懈努力的动力，让我在实验室里感受到家的温暖。另外，赞美我的两位同窗，不辞辛苦地陪伴着我。参考文献涂健，王艳萍，彭开松，等.内毒素诱发鸡多脏器损伤及其对肝TLR4mRNA 表达影响［J］.生物学杂志，2007，613-15.鲍华英，陈荣华.姜黄素的研究进展[J]. 国外医学儿科学分册，2003,30（5）:254－256.王艳萍，祁克宗，涂健，等.内毒素对仔鸡血浆SOD 活性及MDA 水平的影响［J］.动物医学进展，2006，563-65.糖传核，彭志英.姜黄素类物质的生理功能以及其抗氧化机制[J].中国食品添加剂，2000(4):40－44.陈巍峰. 姜黄素及其类似物的抗氧化活性研究[D]. 兰州: 兰州大学,2006.王恬，张婧菲.姜黄素的理化特性、抗氧化功能及其在肉鸡生产中的应用[N].动物营养学报，2014，26（10）3101-3107.Rukkumani R，Sri Balasubashini M，Vishwanathan P，et a1．Comparative effects of curcumin and photo-imidiated curcumin on alcoho1-and polyunsaturated fatty acid-induced hyperlipidemia[J]．Pharmscol Res，2002，46(3)257-64赵珍东.姜黄素抗肝纤维化作用及机理研究[J]. 中国实验方剂学杂志，2010; 16( 3) : 122-125.狄建彬,顾振纶,赵笑东,等. 姜黄素防治大鼠高脂性脂肪肝的研究[J]. 中草药, 2010, 41（8）: 1 322-1326.闰爱国，葛挣艳，刘建勋，等.降糖消脂胶囊对2型糖尿病大鼠模型的胰岛及肝脏形态学改变的影响[J].中国中药杂志，2008,33（9）:1068-1070.周显青，梁洪蒙．拥挤胁迫下小鼠肝脏脂质过氧化物含量和抗氧化物酶活性的变化［J］．动物学研究，2003，24（3）238－240．丁可祥．SOD临床研究集［M］．北京原子能出版社，19921－12．顾军，龚锦涵，殷岳保，等．高压氧间断暴露及氧惊厥对大鼠抗氧化酶活力及脂质过氧化物含量的影响［J］．中华航海医学杂志，1995，2（4）31－34．石晶，陶沂，胡晋红，等．姜黄素对缺血再灌注大鼠脑组织SOD，MDA和亚硝酸盐含量的影响[J]．第二军医大学学报，1999，20(6)386-7．ZHENG Shizhong, FU Yumei, CHEN Anping. 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目录
摘要 1
关键字 1
ABSTRACT 1
KEYWORDS 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1试验材料 2
1.2试验设计 2
1.3饲养管理 2
1.4 样品采集 2
1.5 制备10%的肝脏组织匀浆 2
1.6测定指标与方法 2
1.6.1肝脏抗氧化能力测定 2
1.6.2 荧光定量PCR 2
1.6.2.1 RNA提取 2
1.6.2.2 反转录 3
1.6.2.3 实时定量PCR步骤 3
1.7数据处理与统计 3
2 结果分析 3
2.1姜黄素对断奶仔猪肝脏形态学的影响 3
2.2姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化性能的影响 4
2.3姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化基因表达量的影响 4
2.4姜黄素对断奶仔猪肝脏热休克蛋白基因表达的影响 5
3 讨论 5
3.1姜黄素对断奶仔猪肝脏形态学的影响 5
3.2 姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化性能的影响 5
3.3姜黄素对断奶仔猪肝脏抗氧化基因表达量的影响 6
3.4姜黄素对断奶仔猪肝脏热休克蛋白基因表达的影响 6
4 结论 7
致谢 7
参考文献： 7
姜黄素对免疫应激断奶仔猪肝脏抗氧化性能的影响
引言
引言
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