溶菌酶对瘤胃体外发酵参数及功能菌群数量的影响
本试验旨在通脱体外发酵法研究溶菌酶不对瘤胃发酵参数和功能菌群数量的影响。试验分为五组，每组四个重复，溶菌酶添加量分别为0、0.1、1、10、100mg/100mL。分别于3、6、9、12、24h测定产气量和甲烷产量，24h后终止发酵，采样测定发酵参数和功能菌群数量。结果显示与对照组相比，1、10和100mg/100mL溶菌酶处理组的甲烷产量显著降低（P<0.05)，10、100mg/100mL溶菌酶处理组的总产气量、有机物消失率和干物质消失率显著降低（P<0.05)；和对照组相比，100mg/100mL溶菌酶处理组总挥发酸的产量显著降低（P<0.05)；和对照组相比，除0.1mg/100ml处理组外，溶菌酶所有添加组的丙酸含量均显著增加（P<0.05)，乙丙比显著降低（P<0.05)；实时定量PCR结果显示，100mg/100mL溶菌酶处理组的总菌、厚壁菌门、拟杆菌门、产甲烷菌数量与对照组相比显著降低（P<0.05)，10mg/100mL溶菌酶处理组硫还原菌数量与对照组相比显著升高（P<0.05)。由上可知，在本试验体外发酵条件下，添加适量浓度溶菌酶有降低甲烷产量、增加丙酸酸产量和降低乙丙比的效果，但添加量过高影响瘤胃发酵效率，1mg/100mL为最适宜添加量。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 2
引言 2
1 材料与方法 2
1．1 试验设计 2
1．2 试验材料 2
1.2.1 溶菌酶 2
1.2.2 发酵底物 2
1.2.3 瘤胃液采集及培养液配置 2
1.2.4 实验仪器 3
1. 3 测定指标与方法 3
1.3.1 产气量 3
1.3.2 甲烷 3
1.3.3 pH值 4
1.3.4 干物质消失率、有机物消失率 4
1.3.5 挥发酸(VFA） 4
1.3.6 微生物蛋白（MCP） 4
1.3.7 瘤胃氨态氮（NH3N） 4
1．4 微生物区系变化测定 4
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1.4.1 DNA提取 4
1.4.2 DNA质量及浓度检测 4
1.4.3 Realtime PCR引物设计 4
1.4.4 反应体系与条件 5
1.5 数据分析 5
2 结果与分析 5
2．1 溶菌酶对瘤胃体外发酵产气量和甲烷的影响 5
2．2 溶菌酶对瘤胃体外发酵营养物质降解率的影响 6
2. 3 溶菌酶体外发酵NH3N和MCP的影响 6
2. 4 溶菌酶对瘤胃体外发酵pH值的影响 7
2. 5 溶菌酶对体外发酵VFA的影响 7
2. 6 溶菌酶对瘤胃体外发酵功能菌数量的影响 7
3 讨论 8
4 结论 9
致谢 9
参考文献 9
溶菌酶对瘤胃体外发酵参数及功能菌群数量的影响
引言
反刍动物产生的甲烷通过嗳气排出，不仅加剧了温室效应，还造成了215%饲料能量的损失，降低饲料利用率[1]。抗生素能有效控制瘤胃微生物数量，降低甲烷产量，但其存在易产生耐药性和容易残留等问题。寻找安全有效的抗生素替代物变得非常必要。溶菌酶作为动物体内本身存在的非特异性免疫因子对革兰氏阳性菌有抗菌作用，而对无细胞壁的动物细胞无影响，而且其广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，亦存在于哺乳动物的体液、体液、尿液、胎盘和血浆中，是理想的饲用抗生素替代品，溶菌酶已被许多国家应用于食品及饲料添加剂领域[2]。在动物生产上，溶菌酶多报道于断奶仔猪的腹泻治疗上。仔猪饲喂溶菌酶，腹泻率显著降低，对引起腹泻的埃希氏大肠杆菌和轮状病毒有较强的抑制作用[3]。Nyachoti等让感染EscherichiacoliK88+的仔猪口服溶菌酶溶液后发现，溶菌酶能显著抑制EscherichiacoliK88+的生长[4]。王小可等研究表明日粮中添加300g/t和500g/t的溶菌酶使断奶仔猪的日增重分别提高8.88%和16.88%；料肉比降低6.00%和12.00%；腹泻率降低77%和92%[5]。李志华等发现添加溶菌酶能显著提高华北柴鸡日粮中日粮中粗脂肪的消化率,显著改善饲料转化率,提高华北柴鸡生产性能的效果[6]。李刚诗等研究发现溶菌酶对围产期奶牛的免疫抑制有缓解作用[7]。杨睿等研究四种不同来源的溶菌酶对奶牛乳房炎病原菌葡萄球菌的抑制效果时，发现细菌性溶菌酶SK活性最好[8]。溶菌酶在反刍动物上体外发酵试验鲜有报道，本试验拟利用体外静态模拟瘤胃发酵法，通过添加不同梯度浓度的溶菌酶来探讨其对瘤胃发酵参数以及功能菌群的影响，为其在反刍动物生产上的应用提供科学依据。
1 材料与方法
1．1 试验设计
本试验采用单因素试验设计，溶菌酶添加量为0、0.1、1、10、100mg/100mL，共五组，每组四个重复。长三角洲白山羊为瘤胃液供体，进行体外发酵。
1．2 试验材料
1.2.1 溶菌酶 本试验用溶菌酶（鸡蛋清）为AMRESCO公司生产，品牌为Amresco0663，活性 ≥2000u/mg。
1.2.2 发酵底物 本试验发酵底物精粗比为1:1，其中玉米0.34g、豆粕0.16、羊草0.5g。发酵底物用植物粉碎机粉碎过1mm筛。
1.2.3 瘤胃液采集及培养液配置 瘤胃液采自大学动物房三只健康成年长三角洲白山羊，分圈饲养。试验前1d于早饲前空腹称重，根据平均体重确定营养水平和采食量。干物质采食量按体重的3.5%计算，精粗比为6:4，自由饮水。，使用口腔胃管采集三只羊瘤胃液，并迅速装入充满CO2的保温瓶里，迅速带回实验室，过滤后放入在磁力搅拌器上的培养液中，全部过程严格厌氧。
参照Theodorou等[9]方法配制培养基，发酵用培养基组成见表1，培养基由A、B、C、D和E五部分组成，在2341mL蒸馏水中加入4.5mL溶液A、936.45mL溶液B、936.45 mL溶液C及4.5mL溶液D，通CO2饱和后放置于39℃恒温水浴箱中15～16h，加入3.15g半胱氨酸盐酸盐及4.5gNa2S，混匀后通CO2至饱和并加热至39℃，继续通CO20.5～1.0h。过滤后的瘤胃液在厌氧条件下与缓冲液充分混合（瘤胃液：缓冲液体积比10:90），厌氧分装于发酵瓶中；发酵瓶中通入无氧CO2至加盖密封，将100mL培养液分装入发酵瓶中（90mL培养基+10mL接种物）；使用异丁基塑胶塞塞住瓶口，再用铝盖密封，用针头放气平衡内外压力；置于39℃恒温水浴箱中恒温培养24h。
表1培养基组成
Table1 Medium composition
溶液（solution）
体积（volume）
组成（composition）
A微量元素溶液
100mL
CaCl22H2O 13.2g, MnCl24H2O 10.0g, CoCl26H2O 1.0g, FeCl36H2O 8.0g
B缓冲液
1000mL
NH4HCO3 4.0g，NaHCO3 35.0g
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 2
引言 2
1 材料与方法 2
1．1 试验设计 2
1．2 试验材料 2
1.2.1 溶菌酶 2
1.2.2 发酵底物 2
1.2.3 瘤胃液采集及培养液配置 2
1.2.4 实验仪器 3
1. 3 测定指标与方法 3
1.3.1 产气量 3
1.3.2 甲烷 3
1.3.3 pH值 4
1.3.4 干物质消失率、有机物消失率 4
1.3.5 挥发酸(VFA） 4
1.3.6 微生物蛋白（MCP） 4
1.3.7 瘤胃氨态氮（NH3N） 4
1．4 微生物区系变化测定 4
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1.4.1 DNA提取 4
1.4.2 DNA质量及浓度检测 4
1.4.3 Realtime PCR引物设计 4
1.4.4 反应体系与条件 5
1.5 数据分析 5
2 结果与分析 5
2．1 溶菌酶对瘤胃体外发酵产气量和甲烷的影响 5
2．2 溶菌酶对瘤胃体外发酵营养物质降解率的影响 6
2. 3 溶菌酶体外发酵NH3N和MCP的影响 6
2. 4 溶菌酶对瘤胃体外发酵pH值的影响 7
2. 5 溶菌酶对体外发酵VFA的影响 7
2. 6 溶菌酶对瘤胃体外发酵功能菌数量的影响 7
3 讨论 8
4 结论 9
致谢 9
参考文献 9
溶菌酶对瘤胃体外发酵参数及功能菌群数量的影响
引言
反刍动物产生的甲烷通过嗳气排出，不仅加剧了温室效应，还造成了215%饲料能量的损失，降低饲料利用率[1]。抗生素能有效控制瘤胃微生物数量，降低甲烷产量，但其存在易产生耐药性和容易残留等问题。寻找安全有效的抗生素替代物变得非常必要。溶菌酶作为动物体内本身存在的非特异性免疫因子对革兰氏阳性菌有抗菌作用，而对无细胞壁的动物细胞无影响，而且其广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，亦存在于哺乳动物的体液、体液、尿液、胎盘和血浆中，是理想的饲用抗生素替代品，溶菌酶已被许多国家应用于食品及饲料添加剂领域[2]。在动物生产上，溶菌酶多报道于断奶仔猪的腹泻治疗上。仔猪饲喂溶菌酶，腹泻率显著降低，对引起腹泻的埃希氏大肠杆菌和轮状病毒有较强的抑制作用[3]。Nyachoti等让感染EscherichiacoliK88+的仔猪口服溶菌酶溶液后发现，溶菌酶能显著抑制EscherichiacoliK88+的生长[4]。王小可等研究表明日粮中添加300g/t和500g/t的溶菌酶使断奶仔猪的日增重分别提高8.88%和16.88%；料肉比降低6.00%和12.00%；腹泻率降低77%和92%[5]。李志华等发现添加溶菌酶能显著提高华北柴鸡日粮中日粮中粗脂肪的消化率,显著改善饲料转化率,提高华北柴鸡生产性能的效果[6]。李刚诗等研究发现溶菌酶对围产期奶牛的免疫抑制有缓解作用[7]。杨睿等研究四种不同来源的溶菌酶对奶牛乳房炎病原菌葡萄球菌的抑制效果时，发现细菌性溶菌酶SK活性最好[8]。溶菌酶在反刍动物上体外发酵试验鲜有报道，本试验拟利用体外静态模拟瘤胃发酵法，通过添加不同梯度浓度的溶菌酶来探讨其对瘤胃发酵参数以及功能菌群的影响，为其在反刍动物生产上的应用提供科学依据。
1 材料与方法
1．1 试验设计
本试验采用单因素试验设计，溶菌酶添加量为0、0.1、1、10、100mg/100mL，共五组，每组四个重复。长三角洲白山羊为瘤胃液供体，进行体外发酵。
1．2 试验材料
1.2.1 溶菌酶 本试验用溶菌酶（鸡蛋清）为AMRESCO公司生产，品牌为Amresco0663，活性 ≥2000u/mg。
1.2.2 发酵底物 本试验发酵底物精粗比为1:1，其中玉米0.34g、豆粕0.16、羊草0.5g。发酵底物用植物粉碎机粉碎过1mm筛。
1.2.3 瘤胃液采集及培养液配置 瘤胃液采自大学动物房三只健康成年长三角洲白山羊，分圈饲养。试验前1d于早饲前空腹称重，根据平均体重确定营养水平和采食量。干物质采食量按体重的3.5%计算，精粗比为6:4，自由饮水。，使用口腔胃管采集三只羊瘤胃液，并迅速装入充满CO2的保温瓶里，迅速带回实验室，过滤后放入在磁力搅拌器上的培养液中，全部过程严格厌氧。
参照Theodorou等[9]方法配制培养基，发酵用培养基组成见表1，培养基由A、B、C、D和E五部分组成，在2341mL蒸馏水中加入4.5mL溶液A、936.45mL溶液B、936.45 mL溶液C及4.5mL溶液D，通CO2饱和后放置于39℃恒温水浴箱中15～16h，加入3.15g半胱氨酸盐酸盐及4.5gNa2S，混匀后通CO2至饱和并加热至39℃，继续通CO20.5～1.0h。过滤后的瘤胃液在厌氧条件下与缓冲液充分混合（瘤胃液：缓冲液体积比10:90），厌氧分装于发酵瓶中；发酵瓶中通入无氧CO2至加盖密封，将100mL培养液分装入发酵瓶中（90mL培养基+10mL接种物）；使用异丁基塑胶塞塞住瓶口，再用铝盖密封，用针头放气平衡内外压力；置于39℃恒温水浴箱中恒温培养24h。
表1培养基组成
Table1 Medium composition
溶液（solution）
体积（volume）
组成（composition）
A微量元素溶液
100mL
CaCl22H2O 13.2g, MnCl24H2O 10.0g, CoCl26H2O 1.0g, FeCl36H2O 8.0g
B缓冲液
1000mL
NH4HCO3 4.0g，NaHCO3 35.0g
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