大豆疫霉psgpa1互作蛋白的筛选与鉴定
摘要：大豆疫霉(Phytophthora sojae)作为重要的植物病原卵菌之一，在大豆生产中引起毁灭性的病害——大豆疫霉根腐病。大豆疫霉无性生活史阶段产生孢子囊，释放游动孢子。在田间传播过程中，游动孢子识别寄主分泌的化学信号，定向游动休止完成对寄主植物的侵染。因此，了解大豆疫霉游动孢子趋化性的分子调控机制，可以为有效的病害防控策略提供新的思路及方向。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言： 4
1 材料与方法 4
1．1 供试菌株和质粒 4
1．2 供试培养基 5
1．3 供试试剂 5
1．4 4个候选基因原核表达载体的构建 5
1. 4. 1 5
1. 4. 2 5
1. 4. 3 5
1. 5 大肠杆菌感受态制备(热激) 6
1. 6 热激转化 6
1. 7 6
1. 8 7
1. 9 诱导原核蛋白表达 7
1. 10 GST－pull down操作步骤 7
1. 11 Western blot 检测蛋白表达情况 8
2 结果与分析 8
2. 1 原核表达载体构建，菌落PCR验证 8
2．2 原核诱导蛋白表达条件探索 8
2．3 GSTpull down处理，western blot结果 9
3 讨论 10
致谢 10
参考文献： 10
大豆疫霉Ps_GPA1互作蛋白的筛选与鉴定
植物保护 徐愿鹏
引言
引言
G蛋白即异三聚体鸟嘌呤核苷结合蛋白，是在进化中高度保守的蛋白家族，通常是由G(、G(和G(三个不同亚基组成，在细胞信号传导途径中起到重要作用。其中G(亚基能够与鸟嘌呤核苷（GDP/GTP）结合并自身具有GTP水解酶活性，G(和G(亚基总是结合在一起形成二聚体。通常的情况下，当G(与GDP结合时
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
，(、(和(三个亚基以三聚体的形式存在，而当G(与GTP结合时，则三者分为G(亚基和G((二聚体两部分，分别行使调控作用［1］。
G蛋白信号途径在真核生物中广泛存在并且非常保守。在拟南芥中通过对突变体的研究证明，G蛋白能够调控离子通道，控制种子萌发、光反应、细胞分裂及延长，以及对ABA、赤霉素等的反应。并且拟南芥中G(的直接互作蛋白PLD (1在拟南芥保卫细胞ABA 信号转导途径中起着重要作用[2]。酵母一般含有两个G(，而大多数已报道的丝状真菌中有三个G(，并且G(的缺失会影响病原菌的产孢能力及其致病性。在酵母中G(直接结合MAPK途径，进而调控交配信号和向药性反应。很多的实验证明，在绝大多数丝状真菌中G(可以调控MAPK、PKA途径，从而影响信息素的感应、子实体形成、致病性等[3]。
在卵菌中，Laxlt等于2002年在致病疫霉中首次克隆到G蛋白的(和β亚基［4］，研究表明，G(不仅影响着致病疫霉孢子囊的割裂，还控制着游动孢子的游动能力和附着孢的形成［56］。大豆疫霉基因组中存在一个G(和两个Gβ，已有研究表明，G(的沉默导致游动孢子对异黄酮类物质的趋化性丧失并且休止速度加快，从而影响了突变体在大豆根部的附着能力［78］。
大豆疫霉的游动孢子对异黄酮类物质的趋化性是识别和侵染寄主的前提，是病害循环中非常重要的一步，然而，这种趋化性的分子机制目前没有完全清楚，现在已知G(是一个关键因子，所以本研究从这个线索出发，拟采用CoIP的技术筛选G(的互作蛋白，然后利用GST pulldown技术鉴定这些互作蛋白旨在寻找更多的G(的下游的信号分子，来解释G(是通过哪些途径来调控趋化性、进而控制致病性。
1 材料与方法
1．1 供试菌株和质粒
感受态细胞（大肠杆菌菌株Jm109 用于载体的构建，自身无抗性，以LB培养基进行恢复和保存培养）；大肠杆菌菌株BL21（用于原核蛋白表达，以2*YT培养基进行恢复、诱导培养，可以LB培养基保存培养）；原核表达载体pet28a（his tag;KN抗性）
1．2 供试培养基
用于培养大肠杆菌的固体LB培养基
固体LB培养基(每升)：tryptone：10g：yeast extract：5g；NaCl：10g；琼脂粉（每200ml加3g）。用水定容到1升。
用于诱导原核表达的液体2*YT培养基
液体2*YT培养基（每升）：tryptone：16g：yeast extract：10g：NaCl：5g
1．3 供试试剂
1. 3. 1 本研究所有限制性酶切、PCR扩增的酶、连接反应所用T4DNA连接酶和相
光试剂均购于TaKaRa公司(Dalian，China)。
1．4 4个候选基因原核表达载体的构建
分别设计4个候选基因PCR扩增的上下游引物并酶切pet28a载体质粒；利用Infusion的方法连接片段和载体，构建原核表达载体。
1. 4. 1
PCR高保真体系扩增候选基因片段，PCR体系如下：
1. 4. 2
pet28a载体酶切体系（双酶切HindⅢ＆BamHⅠ）如下：
1. 4. 3
infusion连接体系如下
1. 5 大肠杆菌感受态制备(热激)
2M MgSO4:12.3g MgSO47H2O定容到50mlddH2O
PIPES:15.1g PIPES＋80mlH2O用KOH调节PH至6.7,定容到100ml,至于20℃保存。
Inove制备（100ml）:
1.088g MnCl24H2O＋0.220g CaCl22H2O＋1.865g KCl 溶于80ml纯水，再加入2ml制备好的PIPES,混合，定容至100ml,过滤除菌，20℃保存待用。
在超净台中划线：取出70℃保存的JM109甘油菌，划线，37℃过夜
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言： 4
1 材料与方法 4
1．1 供试菌株和质粒 4
1．2 供试培养基 5
1．3 供试试剂 5
1．4 4个候选基因原核表达载体的构建 5
1. 4. 1 5
1. 4. 2 5
1. 4. 3 5
1. 5 大肠杆菌感受态制备(热激) 6
1. 6 热激转化 6
1. 7 6
1. 8 7
1. 9 诱导原核蛋白表达 7
1. 10 GST－pull down操作步骤 7
1. 11 Western blot 检测蛋白表达情况 8
2 结果与分析 8
2. 1 原核表达载体构建，菌落PCR验证 8
2．2 原核诱导蛋白表达条件探索 8
2．3 GSTpull down处理，western blot结果 9
3 讨论 10
致谢 10
参考文献： 10
大豆疫霉Ps_GPA1互作蛋白的筛选与鉴定
植物保护 徐愿鹏
引言
引言
G蛋白即异三聚体鸟嘌呤核苷结合蛋白，是在进化中高度保守的蛋白家族，通常是由G(、G(和G(三个不同亚基组成，在细胞信号传导途径中起到重要作用。其中G(亚基能够与鸟嘌呤核苷（GDP/GTP）结合并自身具有GTP水解酶活性，G(和G(亚基总是结合在一起形成二聚体。通常的情况下，当G(与GDP结合时
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
，(、(和(三个亚基以三聚体的形式存在，而当G(与GTP结合时，则三者分为G(亚基和G((二聚体两部分，分别行使调控作用［1］。
G蛋白信号途径在真核生物中广泛存在并且非常保守。在拟南芥中通过对突变体的研究证明，G蛋白能够调控离子通道，控制种子萌发、光反应、细胞分裂及延长，以及对ABA、赤霉素等的反应。并且拟南芥中G(的直接互作蛋白PLD (1在拟南芥保卫细胞ABA 信号转导途径中起着重要作用[2]。酵母一般含有两个G(，而大多数已报道的丝状真菌中有三个G(，并且G(的缺失会影响病原菌的产孢能力及其致病性。在酵母中G(直接结合MAPK途径，进而调控交配信号和向药性反应。很多的实验证明，在绝大多数丝状真菌中G(可以调控MAPK、PKA途径，从而影响信息素的感应、子实体形成、致病性等[3]。
在卵菌中，Laxlt等于2002年在致病疫霉中首次克隆到G蛋白的(和β亚基［4］，研究表明，G(不仅影响着致病疫霉孢子囊的割裂，还控制着游动孢子的游动能力和附着孢的形成［56］。大豆疫霉基因组中存在一个G(和两个Gβ，已有研究表明，G(的沉默导致游动孢子对异黄酮类物质的趋化性丧失并且休止速度加快，从而影响了突变体在大豆根部的附着能力［78］。
大豆疫霉的游动孢子对异黄酮类物质的趋化性是识别和侵染寄主的前提，是病害循环中非常重要的一步，然而，这种趋化性的分子机制目前没有完全清楚，现在已知G(是一个关键因子，所以本研究从这个线索出发，拟采用CoIP的技术筛选G(的互作蛋白，然后利用GST pulldown技术鉴定这些互作蛋白旨在寻找更多的G(的下游的信号分子，来解释G(是通过哪些途径来调控趋化性、进而控制致病性。
1 材料与方法
1．1 供试菌株和质粒
感受态细胞（大肠杆菌菌株Jm109 用于载体的构建，自身无抗性，以LB培养基进行恢复和保存培养）；大肠杆菌菌株BL21（用于原核蛋白表达，以2*YT培养基进行恢复、诱导培养，可以LB培养基保存培养）；原核表达载体pet28a（his tag;KN抗性）
1．2 供试培养基
用于培养大肠杆菌的固体LB培养基
固体LB培养基(每升)：tryptone：10g：yeast extract：5g；NaCl：10g；琼脂粉（每200ml加3g）。用水定容到1升。
用于诱导原核表达的液体2*YT培养基
液体2*YT培养基（每升）：tryptone：16g：yeast extract：10g：NaCl：5g
1．3 供试试剂
1. 3. 1 本研究所有限制性酶切、PCR扩增的酶、连接反应所用T4DNA连接酶和相
光试剂均购于TaKaRa公司(Dalian，China)。
1．4 4个候选基因原核表达载体的构建
分别设计4个候选基因PCR扩增的上下游引物并酶切pet28a载体质粒；利用Infusion的方法连接片段和载体，构建原核表达载体。
1. 4. 1
PCR高保真体系扩增候选基因片段，PCR体系如下：
1. 4. 2
pet28a载体酶切体系（双酶切HindⅢ＆BamHⅠ）如下：
1. 4. 3
infusion连接体系如下
1. 5 大肠杆菌感受态制备(热激)
2M MgSO4:12.3g MgSO47H2O定容到50mlddH2O
PIPES:15.1g PIPES＋80mlH2O用KOH调节PH至6.7,定容到100ml,至于20℃保存。
Inove制备（100ml）:
1.088g MnCl24H2O＋0.220g CaCl22H2O＋1.865g KCl 溶于80ml纯水，再加入2ml制备好的PIPES,混合，定容至100ml,过滤除菌，20℃保存待用。
在超净台中划线：取出70℃保存的JM109甘油菌，划线，37℃过夜
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