rapamycin诱导hct116细胞凋亡机制的研究
mTOR信号通路可以通过机体内部和外部信号通路被激活。它对生长、增殖、代谢中的细胞具有十分重要的作用。mTOR在Hct116细胞中通常是过表达。Rapamycin是一种大环内酯类的抗生素，它具有抑制mTOR的功能，但在体外培养的细胞中的机制还不清楚。因此，本研究通过MTS法、流式细胞术、Real-time PCR和Western blot方法探索了Rapamycin在Hct116细胞中诱导细胞凋亡的机制，得到下列结论Rapamycin不仅可以抑制Hct116细胞的生长，还可以诱导细胞凋亡，最适浓度为20μM。更为重要的是，Rapamycin在Hct116细胞中诱导凋亡的过程中依赖于FADD，并能使DR5表达上调；同时，能显著抑制RPS6的磷酸化表达。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验对象 2
1.2实验仪器与试剂3
1.2.1主要材料和试剂3
1.2.2主要仪器3
1.3实验原理与方法3
1.3.1 Hct116细胞的培养3
1.3.2 MTS方法检测不同浓度Rapamycin处理Hct116细胞的生长变化3
1.3.3 流式细胞仪检测Rapamycin诱导的细胞凋亡4
1.3.4 Realtime PCR方法检测相关蛋白的表达4
1.3.5 Western Blot方法检测相关蛋白的表达5
1.4统计学方法6
2结果与分析6
2.1 Rapamycin对Hct116细胞生长的影响6
2.2 Rapamycin对Hct116细胞凋亡的作用6
2.3 Rapamycin诱导Hct116细胞凋亡的机制6
2.3.1 在Hct116细胞中，Rapamycin诱导的凋亡依赖于FADD6
2.3.2 Rapamycin能抑制RPS6磷酸化的表达，使DR5的表达上调7
3讨论8
4结论8
致谢8
参考文献9
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
图12
图23
图35
图46
图56
图66
图77
图88
图98
Rapamycin诱导Hct116细胞凋亡机制的研究
引言
结直肠癌在全世界的范围之内都是一个的重大的癌症，每一年都有超过百万的新发病例和超过六十万的死亡[1]。过去十年中，癌症基因组计划极大提高了我们对癌症生物学以及致癌激酶鉴定频繁体细胞突变的理解[2]。
mTOR (mammalian target of rapamycin)通路可以通过机体内部和外部信号通路激活，对于生长、增殖、代谢等等方面中的细胞具有十分重要作用。于正常的细胞中，mTOR通路可以让细胞处于稳态；但是在疾病中，mTOR通路表达异常。值得注意的是，mTOR通路在Hct116细胞中通常是过度表达[3]。mTOR通路包括mTORC1和 mTORC2两个复合物，它们与Hct116细胞中的肿瘤浸润、转移及干细胞密切相关[4]。mTOR可以接收上游PI3K/AKT, TSC1/TSC2,AMPK等信号，下游可以使S6K和4EBP1磷酸化，进而调控细胞生长、核糖体生成及能量代谢等[5]（图1）。一些研究的成果表明：PI3K /AKT /m TOR信号通路的不正常可能会引起恶性肿瘤的发生，可以通过对mTOR产生作用研制出能够治疗恶性肿瘤的靶向药物。通过部分研究，可以应用于人类癌症的治疗[68]。
Rapamycin是一种天然产物非ATP竞争的mTORC1抑制剂[9]。Rapamycin结合在已结合了高亲和力蛋白的胞质FK（FKBP12）上， FKBP12/rapamycin复合物与mTORC1相互作用，并通过mTOR激酶活性或复合物组装的干扰抑制其功能。在1999年，Rapamycin被FDA批准作为免疫抑制药物。研究表明：Rapamycin可以提高寿命，可以抑制mTOR通路诱导的细胞过度生长并对抑制癌症有一定的作用[10]。同时，Rapamycin可以降低血管内皮生长因子（VEGF）的表达[11]。
mTORC1的是两个主要的mTOR复合物中的一个，并且响应于生长因子PI3K / PTEN/ AKT信号传导的主要下游效应。磷酸化mTORC1的下游标靶，可以增加蛋白质的合成，包括S6K1及其底物核糖体蛋白RPS6和翻译起始抑制剂4EBP1，本文探究了Rapamycin通过对RPS6的抑制作用，进而影响蛋白质的合成，而达到抑制Hct116细胞的增殖的目的。
细胞凋亡与肿瘤的产生和消失关系密切，细胞凋亡有两条途径，一条是由死亡配体及受体等引起的外部途径，具体的来讲，肿瘤的坏死因子受体（比如：DR5）成员与TNF –α，FASL等配体结合形成三聚化而激活，活化的复合物与FADD结合，激活Caspase8，同时，研究表明细胞凋亡在结肠癌细胞中的关键抗肿瘤活性作用是通过DR5，FADD和caspase8轴[1213]；另一条是内部途径，也称线粒体途径，在该途径中，线粒体外膜的改变引起CytoC的释放。
mTOR抑制剂可以通过多条通路发挥作用，本研究主要是探讨Rapamycin在Hct116细胞中诱导细胞凋亡的作用机制，为结肠癌的临床靶向治疗提供依据。
图1：mTOR信号通路
Figure 1.mTOR signalling pathway
1 材料与方法
1．1 实验对象
1．1．1 Hct116细胞
Hct116和FADD KO细胞，从美国菌种的保藏中心引进（Manassas,VA,USA）。
1．1．2 Rapamycin
Rapamycin 是一种大环内酯类的抗生素（图2）。它基本的作用和原理是抑制mTOR从而抑制它下游的4EBP1/elF4E，能阻断了关键的mRNA 翻译，从而导致了细胞凋亡[14]。 Rapamycin不仅仅可以有比较强的免疫抑制的作用，还可以预防一些血管导致的术后冠状动脉的狭窄发生。
图2：rapamycin结构示意图
Figure2. Rapamycin structure
1．2 主要实验试剂与仪器
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验对象 2
1.2实验仪器与试剂3
1.2.1主要材料和试剂3
1.2.2主要仪器3
1.3实验原理与方法3
1.3.1 Hct116细胞的培养3
1.3.2 MTS方法检测不同浓度Rapamycin处理Hct116细胞的生长变化3
1.3.3 流式细胞仪检测Rapamycin诱导的细胞凋亡4
1.3.4 Realtime PCR方法检测相关蛋白的表达4
1.3.5 Western Blot方法检测相关蛋白的表达5
1.4统计学方法6
2结果与分析6
2.1 Rapamycin对Hct116细胞生长的影响6
2.2 Rapamycin对Hct116细胞凋亡的作用6
2.3 Rapamycin诱导Hct116细胞凋亡的机制6
2.3.1 在Hct116细胞中，Rapamycin诱导的凋亡依赖于FADD6
2.3.2 Rapamycin能抑制RPS6磷酸化的表达，使DR5的表达上调7
3讨论8
4结论8
致谢8
参考文献9
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
图12
图23
图35
图46
图56
图66
图77
图88
图98
Rapamycin诱导Hct116细胞凋亡机制的研究
引言
结直肠癌在全世界的范围之内都是一个的重大的癌症，每一年都有超过百万的新发病例和超过六十万的死亡[1]。过去十年中，癌症基因组计划极大提高了我们对癌症生物学以及致癌激酶鉴定频繁体细胞突变的理解[2]。
mTOR (mammalian target of rapamycin)通路可以通过机体内部和外部信号通路激活，对于生长、增殖、代谢等等方面中的细胞具有十分重要作用。于正常的细胞中，mTOR通路可以让细胞处于稳态；但是在疾病中，mTOR通路表达异常。值得注意的是，mTOR通路在Hct116细胞中通常是过度表达[3]。mTOR通路包括mTORC1和 mTORC2两个复合物，它们与Hct116细胞中的肿瘤浸润、转移及干细胞密切相关[4]。mTOR可以接收上游PI3K/AKT, TSC1/TSC2,AMPK等信号，下游可以使S6K和4EBP1磷酸化，进而调控细胞生长、核糖体生成及能量代谢等[5]（图1）。一些研究的成果表明：PI3K /AKT /m TOR信号通路的不正常可能会引起恶性肿瘤的发生，可以通过对mTOR产生作用研制出能够治疗恶性肿瘤的靶向药物。通过部分研究，可以应用于人类癌症的治疗[68]。
Rapamycin是一种天然产物非ATP竞争的mTORC1抑制剂[9]。Rapamycin结合在已结合了高亲和力蛋白的胞质FK（FKBP12）上， FKBP12/rapamycin复合物与mTORC1相互作用，并通过mTOR激酶活性或复合物组装的干扰抑制其功能。在1999年，Rapamycin被FDA批准作为免疫抑制药物。研究表明：Rapamycin可以提高寿命，可以抑制mTOR通路诱导的细胞过度生长并对抑制癌症有一定的作用[10]。同时，Rapamycin可以降低血管内皮生长因子（VEGF）的表达[11]。
mTORC1的是两个主要的mTOR复合物中的一个，并且响应于生长因子PI3K / PTEN/ AKT信号传导的主要下游效应。磷酸化mTORC1的下游标靶，可以增加蛋白质的合成，包括S6K1及其底物核糖体蛋白RPS6和翻译起始抑制剂4EBP1，本文探究了Rapamycin通过对RPS6的抑制作用，进而影响蛋白质的合成，而达到抑制Hct116细胞的增殖的目的。
细胞凋亡与肿瘤的产生和消失关系密切，细胞凋亡有两条途径，一条是由死亡配体及受体等引起的外部途径，具体的来讲，肿瘤的坏死因子受体（比如：DR5）成员与TNF –α，FASL等配体结合形成三聚化而激活，活化的复合物与FADD结合，激活Caspase8，同时，研究表明细胞凋亡在结肠癌细胞中的关键抗肿瘤活性作用是通过DR5，FADD和caspase8轴[1213]；另一条是内部途径，也称线粒体途径，在该途径中，线粒体外膜的改变引起CytoC的释放。
mTOR抑制剂可以通过多条通路发挥作用，本研究主要是探讨Rapamycin在Hct116细胞中诱导细胞凋亡的作用机制，为结肠癌的临床靶向治疗提供依据。
图1：mTOR信号通路
Figure 1.mTOR signalling pathway
1 材料与方法
1．1 实验对象
1．1．1 Hct116细胞
Hct116和FADD KO细胞，从美国菌种的保藏中心引进（Manassas,VA,USA）。
1．1．2 Rapamycin
Rapamycin 是一种大环内酯类的抗生素（图2）。它基本的作用和原理是抑制mTOR从而抑制它下游的4EBP1/elF4E，能阻断了关键的mRNA 翻译，从而导致了细胞凋亡[14]。 Rapamycin不仅仅可以有比较强的免疫抑制的作用，还可以预防一些血管导致的术后冠状动脉的狭窄发生。
图2：rapamycin结构示意图
Figure2. Rapamycin structure
1．2 主要实验试剂与仪器
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