BT传代细胞对裸鼠致瘤性试验
BT传代细胞对裸鼠致瘤性试验[20200507191953]
摘要：为了评价牛睾丸细胞（BT）传代细胞对裸鼠的致瘤性，本试验选取100只裸鼠（雌雄各半），随机分为10组，分别以BT传代细胞F10、F25、F35代活细胞以及冻融细胞以皮下注射方式就其对裸鼠的致瘤性进行了检验，以检验生产疫苗用细胞系是否具有致瘤性。同时以原代CEF活细胞或冻融细胞作为阴性对照，以人喉癌上皮细胞（Hep-2）活细胞和冻融细胞作为阳性对照。研究结果表明，BT传代细胞（F10、F25、F35代）活细胞或冻融细胞、原代CEF活细胞或冻融细胞、以及Hep-2冻融细胞，以皮下注射方式接种处理裸鼠，12周内均不会引起裸鼠体表以及体内各主要器官的肿瘤。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
关键字:裸鼠；牛睾丸细胞；致瘤性；
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1□试验材料与方法2
1.1 □试验材料 2
1.1.1□试验动物2
1.1.2□细胞2
1.1.3□试剂2
1.1.4□主要仪器2
1.2□试验方法 2
1.2.1□鸡胚成纤维细胞的制备2
1.2.2□细胞悬液的制备3
1.2.3□试验分组与接种裸3
1.2.4□接种后观察3
1.2.5□病理切片的制作病理组织学观4
2□结果与分析4
2.1□临床病理形态学观察4
2.2□病理组织学观察4
3□讨论与分析 13
致谢13
参考文献13
图1 裸鼠表观观察5
图 2 Hep-2细胞活细胞组裸鼠皮肤肿瘤的组织学变化6
图 3 BT细胞活细胞组裸鼠的皮肤组织6
图4 心脏组织7
图5 肝脏组织8
图6 脾脏组织9
图7 肺脏组织10
图8 睾丸组织11
图9 卵巢组织12
表1试验分组与处理方法3
BT传代细胞对裸鼠的致瘤性研究
引言
猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒引起的一种急性热性接触性传染病[1]。近几年我国因各种疾病死亡的生猪占饲养总数的8%～10%，其中1/3由猪瘟致死，每年的经济损失达数十亿元，造成了巨大的人力和资源的浪费[2-3]。针对 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
目前我国畜牧业生产的现状，疫苗防治仍是主要的应对措施。我国采取广泛接种猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)的防控措施，本病在我国已经得到有效控制，但该病仍在局部区域散发存在，并造成较大的经济损失[4]。在十年的时间里，中国兔化弱毒疫苗的生产工艺在不断改进和提高，相继创制了家兔脾淋组织苗、乳兔组织苗、犊牛睾丸细胞苗。目前占据市场主导地位的是细胞苗。牛睾丸细胞（BT细胞）是目前生产细胞型猪瘟弱毒疫苗的最主要细胞源。为使用BT传代细胞F10、F25、F35代作为猪瘟细胞疫苗生产用细胞系，应检查其是否具有致瘤性，以保证疫苗的使用安全。
1 材料与方法
1．1 试验材料
1．1．1 试验动物
Balb/c-nu/nu裸鼠100只，雌雄各半，2月龄。由东南大学实验动物中心提供（使用批号：SYXK(苏)2010-0004），随机分为10组，每组10只，雌雄各半。
1．1．2 细胞
BT细胞和人喉癌细胞（Hep-2细胞）由中国兽医药品监察所提供。9-10日龄SPF鸡胚成纤维细胞（CEF细胞）由大学基础病理实验室制备。
1．1．3 试剂
MEM细胞营养液购自Gibico公司，胎牛血清和胰酶购自Hyclone公司，苏木素体细胞染色液购自福州迈新生物技术开发有限公司，伊红染液购自无锡市江原实业技贸总公司，试剂试验用甲醇、乙醇、甲醛、二甲苯均为市售分析纯。
1．1．4 主要仪器
高速冷冻离心机、CO2培养箱、隔水式恒温培养箱、LEICA RM2235手动轮转式切片机、Axio Imager A2荧光显微镜、SW-CJ-1F双面性超净工作台。
1．2 试验方法
1.2.1鸡胚成纤维细胞的制备???
1.2.1.1 取材
选用9～11日龄的SPF鸡胚,用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。用碘酊、酒精消毒蛋壳。用镊子打开气室。用高压灭菌的眼科剪和眼科镊取出鸡胚，减去四肢，头部和内脏，仅剩胴体置于0.01MPB缓冲液（pH=7.4）中。然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块,再用0.01MPBS缓冲液清洗3遍，至组织块发白为止[5-7]。
1.2.1.2分离培养
将剪碎的组织块移入广口瓶中,加入适量的0.25%胰蛋白酶10ml，37℃，20min消化，每隔5min震荡一次，。当组织块变得蓬松边缘透明时，用血清终止消化后，用1000μl枪头反复吹打组织约10次，形成细胞悬液，800r/min离心10min后吸弃消化液，用PBS缓冲液洗2遍，除去失火的消化酶。用四层高压灭菌纱布过滤后细胞计数铺板，每个细胞瓶细胞数为5×107，置于37℃，5%CO2环境贴壁培养，MEM培养液中包含10%FBS，100UI青链霉素。
1.2.1.3 传代培养
原代成纤维细胞贴壁培养24小时后观察，换液。继续培养至成纤维细胞铺满细胞瓶。待细胞铺满细胞瓶后，用0.25%胰酶消化，1传3比例，传代培养，以获得足够的细胞数。每天观察，隔天换液，培养条件如上所述。
1.2.1.4消化和计数
实验当天，用胰酶消化贴壁细胞，显微镜下细胞计数，获取5×107/ml个细胞。如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
液调整。
1.2.1细胞悬液的制备
将处于对数生长期的BT细胞F10代、F25代和F35代、致瘤性Hep-2细胞（F372代）的细胞单层和原代CEF细胞单层按常规方法进行胰酶消化后，1500rpm离心10 min，弃去上清，加入不含血清的MEM培养液。将细胞悬液适当稀释后进行细胞计数，根据细胞计数结果调整细胞浓度至107个/0.2 mL。每个样品制备2份，将其中1份反复冻融3次，1份制备成细胞悬液后立即接种裸鼠。阳性对照Hep-2细胞根据细胞计数结果，调整细胞浓度至106个/0.2 mL，每个样品制备2份，其中1份反复冻融3次。
1.2.2 试验分组与接种裸鼠
试验组均设细胞冻融组和活细胞组，同时设立Hep-2阳性对照组和CEF阴性对照组，每组10只裸鼠，雌雄各半，每种细胞样品各接种裸鼠2组，其中活细胞1组，冻融细胞1组，具体分组情况见表1。每只裸鼠左侧或右侧腋下1cm处皮下接种细胞悬液，接种剂量为0.2 mL/只。
表1 试验分组与处理方法
组别 数量（只） 处理方法
BT细胞F10代细胞活细胞组 10 皮下注射，0.2 ml/只
BT细胞F10代细胞冻融细胞组 10 皮下注射，0.2 ml/只
BT细胞F25代细胞活细胞组 10 皮下注射，0.2 ml/只
BT细胞F25代细胞冻融细胞组 10 皮下注射，0.2 ml/只
BT细胞F35代细胞活细胞组 10 皮下注射，0.2 ml/只
BT细胞F35代细胞冻融细胞组 10 皮下注射，0.2 ml/只
Hep-2细胞F372代细胞活细胞组 10 皮下注射，0.2 ml/只
Hep-2细胞F372代细胞冻融细胞组 10 皮下注射，0.2 ml/只
原代CEF细胞活细胞组 10 皮下注射，0.2 ml/只
A：Hep-2细胞活细胞组。B:Hep-2细胞冻融细胞组。C:BT细胞F10代细胞活细胞组。
摘要：为了评价牛睾丸细胞（BT）传代细胞对裸鼠的致瘤性，本试验选取100只裸鼠（雌雄各半），随机分为10组，分别以BT传代细胞F10、F25、F35代活细胞以及冻融细胞以皮下注射方式就其对裸鼠的致瘤性进行了检验，以检验生产疫苗用细胞系是否具有致瘤性。同时以原代CEF活细胞或冻融细胞作为阴性对照，以人喉癌上皮细胞（Hep-2）活细胞和冻融细胞作为阳性对照。研究结果表明，BT传代细胞（F10、F25、F35代）活细胞或冻融细胞、原代CEF活细胞或冻融细胞、以及Hep-2冻融细胞，以皮下注射方式接种处理裸鼠，12周内均不会引起裸鼠体表以及体内各主要器官的肿瘤。
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关键字:裸鼠；牛睾丸细胞；致瘤性；
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1□试验材料与方法2
1.1 □试验材料 2
1.1.1□试验动物2
1.1.2□细胞2
1.1.3□试剂2
1.1.4□主要仪器2
1.2□试验方法 2
1.2.1□鸡胚成纤维细胞的制备2
1.2.2□细胞悬液的制备3
1.2.3□试验分组与接种裸3
1.2.4□接种后观察3
1.2.5□病理切片的制作病理组织学观4
2□结果与分析4
2.1□临床病理形态学观察4
2.2□病理组织学观察4
3□讨论与分析 13
致谢13
参考文献13
图1 裸鼠表观观察5
图 2 Hep-2细胞活细胞组裸鼠皮肤肿瘤的组织学变化6
图 3 BT细胞活细胞组裸鼠的皮肤组织6
图4 心脏组织7
图5 肝脏组织8
图6 脾脏组织9
图7 肺脏组织10
图8 睾丸组织11
图9 卵巢组织12
表1试验分组与处理方法3
BT传代细胞对裸鼠的致瘤性研究
引言
猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由黄病毒科瘟病毒属的猪瘟病毒引起的一种急性热性接触性传染病[1]。近几年我国因各种疾病死亡的生猪占饲养总数的8%～10%，其中1/3由猪瘟致死，每年的经济损失达数十亿元，造成了巨大的人力和资源的浪费[2-3]。针对 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
目前我国畜牧业生产的现状，疫苗防治仍是主要的应对措施。我国采取广泛接种猪瘟兔化弱毒疫苗(HCLV)的防控措施，本病在我国已经得到有效控制，但该病仍在局部区域散发存在，并造成较大的经济损失[4]。在十年的时间里，中国兔化弱毒疫苗的生产工艺在不断改进和提高，相继创制了家兔脾淋组织苗、乳兔组织苗、犊牛睾丸细胞苗。目前占据市场主导地位的是细胞苗。牛睾丸细胞（BT细胞）是目前生产细胞型猪瘟弱毒疫苗的最主要细胞源。为使用BT传代细胞F10、F25、F35代作为猪瘟细胞疫苗生产用细胞系，应检查其是否具有致瘤性，以保证疫苗的使用安全。
1 材料与方法
1．1 试验材料
1．1．1 试验动物
Balb/c-nu/nu裸鼠100只，雌雄各半，2月龄。由东南大学实验动物中心提供（使用批号：SYXK(苏)2010-0004），随机分为10组，每组10只，雌雄各半。
1．1．2 细胞
BT细胞和人喉癌细胞（Hep-2细胞）由中国兽医药品监察所提供。9-10日龄SPF鸡胚成纤维细胞（CEF细胞）由大学基础病理实验室制备。
1．1．3 试剂
MEM细胞营养液购自Gibico公司，胎牛血清和胰酶购自Hyclone公司，苏木素体细胞染色液购自福州迈新生物技术开发有限公司，伊红染液购自无锡市江原实业技贸总公司，试剂试验用甲醇、乙醇、甲醛、二甲苯均为市售分析纯。
1．1．4 主要仪器
高速冷冻离心机、CO2培养箱、隔水式恒温培养箱、LEICA RM2235手动轮转式切片机、Axio Imager A2荧光显微镜、SW-CJ-1F双面性超净工作台。
1．2 试验方法
1.2.1鸡胚成纤维细胞的制备???
1.2.1.1 取材
选用9～11日龄的SPF鸡胚,用新洁尔灭消毒蛋壳10分钟后放净化台。用碘酊、酒精消毒蛋壳。用镊子打开气室。用高压灭菌的眼科剪和眼科镊取出鸡胚，减去四肢，头部和内脏，仅剩胴体置于0.01MPB缓冲液（pH=7.4）中。然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块,再用0.01MPBS缓冲液清洗3遍，至组织块发白为止[5-7]。
1.2.1.2分离培养
将剪碎的组织块移入广口瓶中,加入适量的0.25%胰蛋白酶10ml，37℃，20min消化，每隔5min震荡一次，。当组织块变得蓬松边缘透明时，用血清终止消化后，用1000μl枪头反复吹打组织约10次，形成细胞悬液，800r/min离心10min后吸弃消化液，用PBS缓冲液洗2遍，除去失火的消化酶。用四层高压灭菌纱布过滤后细胞计数铺板，每个细胞瓶细胞数为5×107，置于37℃，5%CO2环境贴壁培养，MEM培养液中包含10%FBS，100UI青链霉素。
1.2.1.3 传代培养
原代成纤维细胞贴壁培养24小时后观察，换液。继续培养至成纤维细胞铺满细胞瓶。待细胞铺满细胞瓶后，用0.25%胰酶消化，1传3比例，传代培养，以获得足够的细胞数。每天观察，隔天换液，培养条件如上所述。
1.2.1.4消化和计数
实验当天，用胰酶消化贴壁细胞，显微镜下细胞计数，获取5×107/ml个细胞。如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
液调整。
1.2.1细胞悬液的制备
将处于对数生长期的BT细胞F10代、F25代和F35代、致瘤性Hep-2细胞（F372代）的细胞单层和原代CEF细胞单层按常规方法进行胰酶消化后，1500rpm离心10 min，弃去上清，加入不含血清的MEM培养液。将细胞悬液适当稀释后进行细胞计数，根据细胞计数结果调整细胞浓度至107个/0.2 mL。每个样品制备2份，将其中1份反复冻融3次，1份制备成细胞悬液后立即接种裸鼠。阳性对照Hep-2细胞根据细胞计数结果，调整细胞浓度至106个/0.2 mL，每个样品制备2份，其中1份反复冻融3次。
1.2.2 试验分组与接种裸鼠
试验组均设细胞冻融组和活细胞组，同时设立Hep-2阳性对照组和CEF阴性对照组，每组10只裸鼠，雌雄各半，每种细胞样品各接种裸鼠2组，其中活细胞1组，冻融细胞1组，具体分组情况见表1。每只裸鼠左侧或右侧腋下1cm处皮下接种细胞悬液，接种剂量为0.2 mL/只。
表1 试验分组与处理方法
组别 数量（只） 处理方法
BT细胞F10代细胞活细胞组 10 皮下注射，0.2 ml/只
BT细胞F10代细胞冻融细胞组 10 皮下注射，0.2 ml/只
BT细胞F25代细胞活细胞组 10 皮下注射，0.2 ml/只
BT细胞F25代细胞冻融细胞组 10 皮下注射，0.2 ml/只
BT细胞F35代细胞活细胞组 10 皮下注射，0.2 ml/只
BT细胞F35代细胞冻融细胞组 10 皮下注射，0.2 ml/只
Hep-2细胞F372代细胞活细胞组 10 皮下注射，0.2 ml/只
Hep-2细胞F372代细胞冻融细胞组 10 皮下注射，0.2 ml/只
原代CEF细胞活细胞组 10 皮下注射，0.2 ml/只
A：Hep-2细胞活细胞组。B:Hep-2细胞冻融细胞组。C:BT细胞F10代细胞活细胞组。
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