猪链球菌滞留菌的分离鉴定(附件)
1猪链球菌是重要的人畜共患病原菌。滞留菌是构成微生物群体中休眠细胞的亚群，因其能够形成对抗生素的耐受性而备受关注。本研究选取了氨基糖苷类、β-内酰胺类、酰胺醇类、四环素类等抗生素，药敏纸片法筛选猪链球菌高度敏感的抗生素。96孔微量稀释法测定细菌最小抑菌浓度(MIC)，并通过100倍MIC抗生素筛选滞留菌，平板计数测定菌落形成单位(CFU)，用于监测滞留水平。结果发现猪链球菌2型血清型菌株ZY05719、5型血清型菌株HN105、Chz型血清型菌株CZ130302、9型血清型菌株WH1609均能在利福平、氯霉素的100倍MIC中形成滞留菌，同一抗生素浓度下猪链球菌不同血清型的滞留水平并不一致。研究还发现，在100倍MIC氨苄青霉素环境中仅猪链球菌2型菌株ZY05719能形成滞留菌。本研究，对猪链球菌病的抗生素使用提供了参考。猪链球菌滞留菌和其抗生素耐受性的研究，在猪链球菌病的抗生素治疗和细菌耐药性的研究中具有重要意义。
目录
引言
引言
滞留菌”的概念最早由Joseph Bigger于1944年首次提出[1]，即金黄色葡萄球菌经高浓度青霉素处理后，有一小部分细菌能够存活；当青霉素作用去除后，这部分细菌重新增殖，并且对青霉素仍然敏感，为了区别于传统意义上因基因突变产生的耐药菌(resistant mutants)，Joseph Bigger 将其命名为“滞留菌”(persisters)。
目前国际上对滞留菌的理解是，当微生物群体在受到抗微生物药物冲击后，绝大多数很快死亡，但是有小部分的微生物亚群(subpopulation)并不能被彻底清除，而是进入休眠状态，这部分不能被彻底清除的微生物亚群被称为是滞留菌[2]。其与被清除的常规细菌在遗传上相同但在表型上不同于常规细菌。细菌形成滞留菌是一种现象，它们有助于细菌群体产生对抗生素的耐受性[3]。这种滞留细胞的抗生物耐受性不同于遗传学上的耐药性。
关于链球菌中滞留细胞的形成知之甚少[4,5]。在致病性链球菌中，人畜共患病猪链球菌（猪链球菌）可以引起非常严重的疾病，如脓毒症，脑膜炎和链球菌中毒性休克综合征[69]。且猪链球菌病是猪群内一种严重的细菌性传染病，在世界范围内多有爆发，给养猪业造成巨大的经济损失。猪链球菌是猪链球菌病的重要病原之一，可感染 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
多种动物，人类接触污染物也可感染该菌，严重时可导致死亡。猪链球菌感染主要可引起急性败血症和脑膜炎，关节炎及化脓性淋巴结炎症状也较多见。发病率和病死率均较高，传播快，使猪链球菌病成为危害养猪业的一大重要传染病[10]。而抗生素广泛用于控制猪链球菌感染（人类和动物），因此研究猪链球菌是否具备产生抗生素耐受性滞留菌的能力，对于在指导猪链球菌病的用药治疗和预防以及避免二次感染有着重大意义。本试验通过平板计数的方法，通过各菌株在100倍MIC抗生素环境下的生长情况，测定其CFU，从而确定了猪链球菌能形成高水平的的滞留菌，且具备对多种抗生素的耐受性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验菌株
猪链球菌2型血清型菌株ZY05719；猪链球菌5型血清型菌株HN105；猪链球菌Chz型血清型菌株CZ130302；猪链球菌9型血清型菌株WH1609，以上菌株均由大学OIE猪链球菌病参考实验室保存。
表1.猪链球菌各血清型菌株来源
Table 1. Sources of each serotype strain of Streptococcus suis
血清型
宿主
症状
分离地点
分离时间
ZY05719
2
猪
败血症
四川
2005
HN105
5
猪
关节炎
河南
2014
CZ130302
Chz
猪
脑膜炎
江苏
2013
WH1609
9
猪
脑膜炎、关节炎
山东
2016
1.1.2 试剂和培养基
壮观霉素、氯霉素、四环素、林可霉素、利福平、红霉素、链霉素、氨苄青霉素、利福平等抗生素的药敏纸片，制造公司为杭州天和微生物试剂有限公司。
壮观霉素、氨苄青霉素、红霉素、四环素、林可霉素和利福平分析级粉末均购自DSBIO。氯霉素分析级粉末购自南京鼎思生物技术有限公司。
壮观霉素溶液：分析天平精确称取壮观霉素粉末0.256g置于10ml离心管，加入足量的超纯水，充分溶解之后定容至10ml，使终浓度为25.6mg/ml，进行过滤灭菌，小份分装后，置于20℃保存。
氨苄青霉素溶液：分析天平精确称取氨苄青霉素粉末0.256g置于10ml离心管，加入足量的超纯水，充分溶解之后定容至10ml，使终浓度为25.6mg/ml，进行过滤灭菌，小份分装后，置于20℃保存。
红霉素溶液：分析天平精确称取红霉素粉末0.256g置于10ml离心管，加入足量的无水乙醇，充分溶解之后定容至10ml，使终浓度为25.6mg/ml，进行过滤灭菌，小份分装后，用铝箔包裹，置于20℃避光保存。
四环素溶液：分析天平精确称取四环素粉末0.256g置于10ml离心管，加入足量的超纯水，充分溶解之后定容至10ml，使终浓度为25.6mg/ml，进行过滤灭菌，小份分装后，用铝箔包裹，置于20℃避光保存。
氯霉素溶液：分析天平精确称取氯霉素粉末0.256g置于10ml离心管，加入足量的无水乙醇，充分溶解之后定容至10ml，使终浓度为25.6mg/ml，进行过滤灭菌，小份分装后，置于20℃保存。
林可霉素溶液：分析天平精确称取林可霉素粉末0.256g置于10ml离心管，加入足量的超纯水，充分溶解之后定容至10ml，使终浓度为25.6mg/ml，进行过滤灭菌，小份分装后，置于20℃保存。
利福平溶液：分析天平精确称取利福平分析级粉末0.256g置于50ml离心管，加入足量的甲醇，充分溶解之后定容至10ml，使终浓度为25.6mg/ml，进行过滤灭菌，小份分装后，置于20℃保存。
THB培养基：天平称取THB粉末12g，加蒸馏水300ml完全溶解后，最后定容至400ml。于高压蒸气灭菌锅内121℃灭菌20min。冷却后于4℃保存
THB平板：天平称取THB粉末12g，琼脂粉6g，加蒸馏水300ml完全溶解后，最后定容至400ml。于高压蒸气灭菌锅内121℃灭菌20min。冷却至适宜温度后铺平板，4℃保存。
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引言
引言
滞留菌”的概念最早由Joseph Bigger于1944年首次提出[1]，即金黄色葡萄球菌经高浓度青霉素处理后，有一小部分细菌能够存活；当青霉素作用去除后，这部分细菌重新增殖，并且对青霉素仍然敏感，为了区别于传统意义上因基因突变产生的耐药菌(resistant mutants)，Joseph Bigger 将其命名为“滞留菌”(persisters)。
目前国际上对滞留菌的理解是，当微生物群体在受到抗微生物药物冲击后，绝大多数很快死亡，但是有小部分的微生物亚群(subpopulation)并不能被彻底清除，而是进入休眠状态，这部分不能被彻底清除的微生物亚群被称为是滞留菌[2]。其与被清除的常规细菌在遗传上相同但在表型上不同于常规细菌。细菌形成滞留菌是一种现象，它们有助于细菌群体产生对抗生素的耐受性[3]。这种滞留细胞的抗生物耐受性不同于遗传学上的耐药性。
关于链球菌中滞留细胞的形成知之甚少[4,5]。在致病性链球菌中，人畜共患病猪链球菌（猪链球菌）可以引起非常严重的疾病，如脓毒症，脑膜炎和链球菌中毒性休克综合征[69]。且猪链球菌病是猪群内一种严重的细菌性传染病，在世界范围内多有爆发，给养猪业造成巨大的经济损失。猪链球菌是猪链球菌病的重要病原之一，可感染 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
多种动物，人类接触污染物也可感染该菌，严重时可导致死亡。猪链球菌感染主要可引起急性败血症和脑膜炎，关节炎及化脓性淋巴结炎症状也较多见。发病率和病死率均较高，传播快，使猪链球菌病成为危害养猪业的一大重要传染病[10]。而抗生素广泛用于控制猪链球菌感染（人类和动物），因此研究猪链球菌是否具备产生抗生素耐受性滞留菌的能力，对于在指导猪链球菌病的用药治疗和预防以及避免二次感染有着重大意义。本试验通过平板计数的方法，通过各菌株在100倍MIC抗生素环境下的生长情况，测定其CFU，从而确定了猪链球菌能形成高水平的的滞留菌，且具备对多种抗生素的耐受性。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验菌株
猪链球菌2型血清型菌株ZY05719；猪链球菌5型血清型菌株HN105；猪链球菌Chz型血清型菌株CZ130302；猪链球菌9型血清型菌株WH1609，以上菌株均由大学OIE猪链球菌病参考实验室保存。
表1.猪链球菌各血清型菌株来源
Table 1. Sources of each serotype strain of Streptococcus suis
血清型
宿主
症状
分离地点
分离时间
ZY05719
2
猪
败血症
四川
2005
HN105
5
猪
关节炎
河南
2014
CZ130302
Chz
猪
脑膜炎
江苏
2013
WH1609
9
猪
脑膜炎、关节炎
山东
2016
1.1.2 试剂和培养基
壮观霉素、氯霉素、四环素、林可霉素、利福平、红霉素、链霉素、氨苄青霉素、利福平等抗生素的药敏纸片，制造公司为杭州天和微生物试剂有限公司。
壮观霉素、氨苄青霉素、红霉素、四环素、林可霉素和利福平分析级粉末均购自DSBIO。氯霉素分析级粉末购自南京鼎思生物技术有限公司。
壮观霉素溶液：分析天平精确称取壮观霉素粉末0.256g置于10ml离心管，加入足量的超纯水，充分溶解之后定容至10ml，使终浓度为25.6mg/ml，进行过滤灭菌，小份分装后，置于20℃保存。
氨苄青霉素溶液：分析天平精确称取氨苄青霉素粉末0.256g置于10ml离心管，加入足量的超纯水，充分溶解之后定容至10ml，使终浓度为25.6mg/ml，进行过滤灭菌，小份分装后，置于20℃保存。
红霉素溶液：分析天平精确称取红霉素粉末0.256g置于10ml离心管，加入足量的无水乙醇，充分溶解之后定容至10ml，使终浓度为25.6mg/ml，进行过滤灭菌，小份分装后，用铝箔包裹，置于20℃避光保存。
四环素溶液：分析天平精确称取四环素粉末0.256g置于10ml离心管，加入足量的超纯水，充分溶解之后定容至10ml，使终浓度为25.6mg/ml，进行过滤灭菌，小份分装后，用铝箔包裹，置于20℃避光保存。
氯霉素溶液：分析天平精确称取氯霉素粉末0.256g置于10ml离心管，加入足量的无水乙醇，充分溶解之后定容至10ml，使终浓度为25.6mg/ml，进行过滤灭菌，小份分装后，置于20℃保存。
林可霉素溶液：分析天平精确称取林可霉素粉末0.256g置于10ml离心管，加入足量的超纯水，充分溶解之后定容至10ml，使终浓度为25.6mg/ml，进行过滤灭菌，小份分装后，置于20℃保存。
利福平溶液：分析天平精确称取利福平分析级粉末0.256g置于50ml离心管，加入足量的甲醇，充分溶解之后定容至10ml，使终浓度为25.6mg/ml，进行过滤灭菌，小份分装后，置于20℃保存。
THB培养基：天平称取THB粉末12g，加蒸馏水300ml完全溶解后，最后定容至400ml。于高压蒸气灭菌锅内121℃灭菌20min。冷却后于4℃保存
THB平板：天平称取THB粉末12g，琼脂粉6g，加蒸馏水300ml完全溶解后，最后定容至400ml。于高压蒸气灭菌锅内121℃灭菌20min。冷却至适宜温度后铺平板，4℃保存。
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