日粮能量水平对湖羊睾丸发育及其ampk表达水平的影响
动物的营养水平是影响其繁殖能力的主要因素之一，不同的能量水平对雄性动物睾丸发育有影响, 而AMPK通路可调节能量平衡，进而影响睾丸发育。本试验对16只体况相近（3月龄）的健康雄性湖羊进行不同能量水平（100%自由采食组、85%能量限饲组、70%能量限饲组、55%能量限饲组）的60d饲喂，称重屠宰，通过对睾丸组织称重、血浆激素水平测定、HE染色、免疫组化和定量PCR等方法，来探究不同能量水平对湖羊睾丸发育及其AMPK表达水平的影响。研究结果表明，限饲组的体重和睾丸重与对照组相比显著降低（P <0.05）；55%限饲组的睾酮水平与其他三组相比显著降低（P<0.05）；70%和55%限饲组的生长激素水平与其他两组相比显著降低（P<0.05）；随着限饲水平的提高，睾丸组织中的生精小管管腔直径逐渐缩小、生精细胞密度下降、精子数量逐渐减少；AMPK-Thr172蛋白主要表达于生精小管中的各级生精细胞核上；各组之间AMPK（mRNA）的表达水平差异显著（P<0.05），其中85%限饲组表达量显著高于其他三组，而其他各组的AMPK表达量逐渐降低；LKB1、mTOR、ULK1、LC3表达水平的变化趋势与AMPK相同。这些结果表明，低能量饲喂可能破坏AMPK的能量平衡作用，使睾丸发育受到抑制。本试验可以为生产中雄性湖羊初情期前的日粮能量需要提供参考依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 2
引言2
1材料与方法2
1.1试验设计 2
1.2主要试剂和仪器设备 2
1.2.1主要试剂2
1.2.2主要仪器2
1.3样品采集、体重、睾丸重的测量 3
1.4睾丸组织石蜡切片 3
1.5 HE染色3
1.6免疫组化 3
1.7 组织总RNA的提取和反转录 4
1.7.1 总RNA的提取4
1.7.2 RNA浓度和纯度检测4
1.7.3 RNA的反转录4
1.8引物设计 4
1.9 PCR反应 5
1.10实时荧光定量PCR5
1.11数据统计分析5 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
2结果6
2.1不同能量水平对湖羊体重、睾丸重、血浆睾酮及生长激素指标的影响 6
2.2不同能量水平对睾丸组织形态学的影响6
2.3 AMPK蛋白在湖羊睾丸组织中的表达定位7
2.4目的基因在湖羊睾丸发育过程中的表达7
2.4.1总RNA的提取结果7
2.4.2模板及目的基因引物验证7
2.4.3不同能量水平对湖羊睾丸组织中AMPK基因表达的影响8
2.4.4不同能量水平对湖羊睾丸组织中AMPK相关基因表达的影响8
3讨论 9
致谢10
参考文献10
日粮能量水平对湖羊睾丸发育及其AMPK表达水平的影响
引言
引言
湖羊是我国特有的优良羔皮用绵羊品种，具有高繁殖力、早期生长快、耐舍饲、耐高温高湿等独特的性状和巨大的经济价值。湖羊羔皮曾是我国传统的出口创汇商品，在国际裘皮市场上享有盛誉,被称为中国的“软宝石”[1]。而营养状况是影响湖羊的高繁殖力的主要因素。营养状况对动物性成熟前生殖发育有重要的作用，并且可能影响其繁殖活动。当营养平衡遭到破坏，相关激素的水平受到影响，会导致繁殖活动的紊乱。近年来动物的繁殖营养调控机制是科学家们争相研究的热点，有大量研究证明营养对动物繁殖机能有影响。
张海涛等发现超早期断奶(10d～15d)的小尾寒羊母羊发情时间高、中水平能量组明显早于低水平组，高、中水平组的发情率也明显高于低水平组[2]。当能量供给不足，将影响母畜的卵泡生长发育和卵母细胞的成熟；体况差的产后母羊通常出现不排卵，延长产后受孕时间[3]。康晓龙发现高能量水平日粮对促进母羊卵泡发育及黄体形成作用比较明显[4]。张金龙等发现能量对受胎率的影响非常明显[5]。李辉等发现不同日粮能量水平对动物的生长性能、繁殖性能、精液品质是有影响的[610]。景炜等研究日粮不同能量和蛋白水平对多浪羊繁殖性能及血液生化指标的影响，得出提高日粮能量水平对多浪羊春季发情率的提高有明显效果[8]。李静在研究日粮能量、蛋白水平对辽宁绒山羊种公羊精液品质和产绒性能的影响中得出日粮高能量水平可显著提高采精量和精液密度，极显著提高有效精子数和冷冻精液生产数量[11]。因此研究不同能量水平对湖羊生殖细胞发育的影响很有意义。
而AMPK（AMP activated protein kinase，腺苷酸活化蛋白激酶）是细胞重要的能量感受器，可调节能量平衡[1214]。它是生物能量代谢调节的关键分子[15]，主要功能是对AMP/ATP比值的调节，即当ATP不足AMP水平升高时，AMPK活化，抑制糖原合成、胆固醇合成，加速葡萄糖氧化、脂肪酸氧化等方式，促进AMP向ATP的转化，从而维持机体的能量平衡。
国内外研究营养对繁殖机能的影响多集中于母羊，而公羊的研究较少。本试验填补了这方面的不足，研究不同能量水平是对湖羊初情期前睾丸发育的影响。而AMPK可调节能量平衡，可能对睾丸的发育有影响。本试验从AMPK表达水平来研究不同能量水平对睾丸发育的影响。
1试验材料和方法
1.1 试验设计
取16只3月龄体况相近的健康雄性湖羊，随机分成四组（A组为100%能量水平组，对照组；B组为85%能量限饲组；C组为70%能量限饲组；D组为55%能量限饲组），试验羊饲养于通风良好的半封闭羊舍内，每日早、晚定点采食，自由饮水。饲养期60d。
1.2 主要试剂和仪器设备
1.2.1 主要试剂 动物切片石蜡（熔点6062℃）；10×PBS和Triton X100；AMPKThr172抗体；HE染液；DAB染色试剂；DNA Maker；LA Taq酶；反转录试剂盒；荧光定量试剂盒。
1.2.2 主要仪器 石蜡切片机；展片机；烘片机；千分之一电子天平；稳压稳流电泳仪；冰箱；可调式微量移液器；高速离心机；PCR扩增仪；实时荧光定量PCR仪；水平摇床；微量分光光度计；自动旋转式混匀仪；自动凝胶成像分析仪。
1.3 样品采集、体重、睾丸重的测量
屠宰前对每只羊的体重进行记录。屠宰之后迅速摘取睾丸组织，记录左右睾丸重量。取睾丸组织两份，一份用预冷的PBS冲洗后放入4%的多聚甲醛溶液中固定；另一份放入冻存管中，液氮速冻后放入80°C冰箱冷冻保存备用。
1.4 睾丸组织石蜡切片
（1）脱水 75%乙醇 1 h 85%乙醇 1 h 95%乙醇 1 h 100%乙醇 Ⅰ 1 h 100%乙醇 Ⅱ 1 h 100%乙醇 Ⅲ 过夜。
（2）透明 50%乙醇和50%二甲苯混合液 30 min 二甲苯 Ⅰ 20 min 二甲苯 Ⅱ
15 min。
（3）透蜡 50%二甲苯和50%石蜡混合液 30 min 石蜡 Ⅰ 1 h 石蜡 Ⅱ 过夜。
（4）包埋 将熔化好的石蜡小心注入金属包埋框中，尽量避免气泡产生，处理好的组织块尽量放入框各个口的中间部位，然后插入准备好的标签纸，待蜡稍微凝固后，将包埋框放到4℃ 冰箱中加速冷却至完全凝固，分离取出蜡块，常温保存。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 2
引言2
1材料与方法2
1.1试验设计 2
1.2主要试剂和仪器设备 2
1.2.1主要试剂2
1.2.2主要仪器2
1.3样品采集、体重、睾丸重的测量 3
1.4睾丸组织石蜡切片 3
1.5 HE染色3
1.6免疫组化 3
1.7 组织总RNA的提取和反转录 4
1.7.1 总RNA的提取4
1.7.2 RNA浓度和纯度检测4
1.7.3 RNA的反转录4
1.8引物设计 4
1.9 PCR反应 5
1.10实时荧光定量PCR5
1.11数据统计分析5 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
2结果6
2.1不同能量水平对湖羊体重、睾丸重、血浆睾酮及生长激素指标的影响 6
2.2不同能量水平对睾丸组织形态学的影响6
2.3 AMPK蛋白在湖羊睾丸组织中的表达定位7
2.4目的基因在湖羊睾丸发育过程中的表达7
2.4.1总RNA的提取结果7
2.4.2模板及目的基因引物验证7
2.4.3不同能量水平对湖羊睾丸组织中AMPK基因表达的影响8
2.4.4不同能量水平对湖羊睾丸组织中AMPK相关基因表达的影响8
3讨论 9
致谢10
参考文献10
日粮能量水平对湖羊睾丸发育及其AMPK表达水平的影响
引言
引言
湖羊是我国特有的优良羔皮用绵羊品种，具有高繁殖力、早期生长快、耐舍饲、耐高温高湿等独特的性状和巨大的经济价值。湖羊羔皮曾是我国传统的出口创汇商品，在国际裘皮市场上享有盛誉,被称为中国的“软宝石”[1]。而营养状况是影响湖羊的高繁殖力的主要因素。营养状况对动物性成熟前生殖发育有重要的作用，并且可能影响其繁殖活动。当营养平衡遭到破坏，相关激素的水平受到影响，会导致繁殖活动的紊乱。近年来动物的繁殖营养调控机制是科学家们争相研究的热点，有大量研究证明营养对动物繁殖机能有影响。
张海涛等发现超早期断奶(10d～15d)的小尾寒羊母羊发情时间高、中水平能量组明显早于低水平组，高、中水平组的发情率也明显高于低水平组[2]。当能量供给不足，将影响母畜的卵泡生长发育和卵母细胞的成熟；体况差的产后母羊通常出现不排卵，延长产后受孕时间[3]。康晓龙发现高能量水平日粮对促进母羊卵泡发育及黄体形成作用比较明显[4]。张金龙等发现能量对受胎率的影响非常明显[5]。李辉等发现不同日粮能量水平对动物的生长性能、繁殖性能、精液品质是有影响的[610]。景炜等研究日粮不同能量和蛋白水平对多浪羊繁殖性能及血液生化指标的影响，得出提高日粮能量水平对多浪羊春季发情率的提高有明显效果[8]。李静在研究日粮能量、蛋白水平对辽宁绒山羊种公羊精液品质和产绒性能的影响中得出日粮高能量水平可显著提高采精量和精液密度，极显著提高有效精子数和冷冻精液生产数量[11]。因此研究不同能量水平对湖羊生殖细胞发育的影响很有意义。
而AMPK（AMP activated protein kinase，腺苷酸活化蛋白激酶）是细胞重要的能量感受器，可调节能量平衡[1214]。它是生物能量代谢调节的关键分子[15]，主要功能是对AMP/ATP比值的调节，即当ATP不足AMP水平升高时，AMPK活化，抑制糖原合成、胆固醇合成，加速葡萄糖氧化、脂肪酸氧化等方式，促进AMP向ATP的转化，从而维持机体的能量平衡。
国内外研究营养对繁殖机能的影响多集中于母羊，而公羊的研究较少。本试验填补了这方面的不足，研究不同能量水平是对湖羊初情期前睾丸发育的影响。而AMPK可调节能量平衡，可能对睾丸的发育有影响。本试验从AMPK表达水平来研究不同能量水平对睾丸发育的影响。
1试验材料和方法
1.1 试验设计
取16只3月龄体况相近的健康雄性湖羊，随机分成四组（A组为100%能量水平组，对照组；B组为85%能量限饲组；C组为70%能量限饲组；D组为55%能量限饲组），试验羊饲养于通风良好的半封闭羊舍内，每日早、晚定点采食，自由饮水。饲养期60d。
1.2 主要试剂和仪器设备
1.2.1 主要试剂 动物切片石蜡（熔点6062℃）；10×PBS和Triton X100；AMPKThr172抗体；HE染液；DAB染色试剂；DNA Maker；LA Taq酶；反转录试剂盒；荧光定量试剂盒。
1.2.2 主要仪器 石蜡切片机；展片机；烘片机；千分之一电子天平；稳压稳流电泳仪；冰箱；可调式微量移液器；高速离心机；PCR扩增仪；实时荧光定量PCR仪；水平摇床；微量分光光度计；自动旋转式混匀仪；自动凝胶成像分析仪。
1.3 样品采集、体重、睾丸重的测量
屠宰前对每只羊的体重进行记录。屠宰之后迅速摘取睾丸组织，记录左右睾丸重量。取睾丸组织两份，一份用预冷的PBS冲洗后放入4%的多聚甲醛溶液中固定；另一份放入冻存管中，液氮速冻后放入80°C冰箱冷冻保存备用。
1.4 睾丸组织石蜡切片
（1）脱水 75%乙醇 1 h 85%乙醇 1 h 95%乙醇 1 h 100%乙醇 Ⅰ 1 h 100%乙醇 Ⅱ 1 h 100%乙醇 Ⅲ 过夜。
（2）透明 50%乙醇和50%二甲苯混合液 30 min 二甲苯 Ⅰ 20 min 二甲苯 Ⅱ
15 min。
（3）透蜡 50%二甲苯和50%石蜡混合液 30 min 石蜡 Ⅰ 1 h 石蜡 Ⅱ 过夜。
（4）包埋 将熔化好的石蜡小心注入金属包埋框中，尽量避免气泡产生，处理好的组织块尽量放入框各个口的中间部位，然后插入准备好的标签纸，待蜡稍微凝固后，将包埋框放到4℃ 冰箱中加速冷却至完全凝固，分离取出蜡块，常温保存。
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