猪six1基因启动子变异位点的筛选及遗传多样性分析
Six1基因是一个肌肉生长发育相关的重要功能基因，可作为一个影响猪生长发育与肌肉品质的重要候选基因。Six1基因在肌肉生长发育中的功能虽然已非常明确，但Six1基因的转录调控机制仍不清楚，该基因上的遗传变异位点是否可以开发出有效的分子标记用于种猪的选育仍需要作进一步的研究。本研究采用高通量测序技术对Six1基因启动子，以及第1内含子1595位点的遗传变异位点在皮特兰×杜洛克猪×长白猪×大白猪四元商品猪群，以及2个国外猪种大白与长白猪，4个中国地方猪种梅山、二花脸、米猪与沙乌头猪，以及1个合成品种苏淮猪中进行了扫描，共检测到了12个遗传变异位点，包括10个单碱基变异位点，1个插入缺失位点，以及1个（CA）n微卫星变异位点。其启动子中的（CA）n微卫星在皮杜长大群体中共存在6种基因型，基因频率最高的基因型组合为19/22。在不同种猪中共存在15种基因型，中国地方猪种主要以20/22与20/20两种基因型为主，而国外猪种主要以22/22、19/22与19/19三种基因型为主。本研究的开展为深入开展Six1基因的转录调控机制奠定了良好的基础。Screening and genetic diversity analysis of variants in porcine Six1 gene promoter Animal science Xingang Wen Tutor Wangjun WuAbstractSix1 a muscle growth gene is associated with important functional genes can be used as a Pigs Growth and important candidate gene for meat quality. Six1 gene function in muscle growth and development although it is very clear, but the mechanisms of transcriptional regulation of gene Six1 remains unclear whether the sites of genetic variation in the gene can develop effective *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
molecular markers for pig breeding remains a need for further study. This study used high-throughput sequencing technology Six1 gene promoter and intron 1 1595 A genetic mutation sites in Pietrain × Duroc × Landrace × Large White pigs four yuan of goods, as well as two State Yorkshire and Landrace pigs, four Chinese local breeds Meishan, Erhualian, Saudi pig pig and rice, as well as a synthetic varieties Suhuai pigs were scanned, detected a total of 12 sites of genetic variation, including 10 single base mutation sites, an indel sites, as well as a (CA) n microsatellite variation sites. Its promoter in the (CA) n microsatellite Pompidou grew up in Communist groups there are six genotypes, the highest frequency of gene genotype combination 19/22. In the presence of different pig CPC 15 genotypes, Chinese local breeds mainly in the 20/22 and 20/20 genotypes based, while the foreign breeds mainly in 22 / 22,19 / 22 and 19/19 three genes type-based. This study was undertaken to carry out Six1 gene transcriptional regulation mechanism has laid a good foundation.Six基因家族属于Homeobox超基因家族，Six1基因是家族成员之一。Six基因家族的成员都具有一个SD（110-115个氨基酸）与HD（60个氨基酸）结构域，这两个结构区域都具有一个特性就是可以与特异的DNA基序结合。这种特异性结合可以活化或抑制相关靶基因的转录对机体的发育起调控作用。在参与肌肉形成的过程中，Six1蛋白可与肌细胞生成素 (myogenin)启动子上的MEF3元件结合，从而活化这个肌肉决定因子 [1]；缺失Six1基因的小鼠在出生时出现了严重的肋骨畸形而死亡，而身体的大部分肌肉表现出严重的肌肉营养不良，尤其是某些轴下肌肉；Six1Six4双基因敲除的鼠表现为颅面与肋骨缺陷和普遍的肌肉发育不全，生肌决定因子myogenin与Myod1在肌刀中的表达也受到了严重的影响 [2]；2012年，Wu等人克隆了猪Six1基因的完整序，进一步，对Six1基因在猪心、肝、脾、肺、肾、胃、脂肪、肌肉等20个组织了检测，结果表明，猪Six1在骨骼肌中具有最高丰度的表达[3]，暗示着Six1在猪骨骼肌的生长发育中可能发挥着非常关键的作用。在许多研究中我们发现，同源异型盒基因Six1作为转录因子，不但与胚胎细胞发育和器官分化有关，而且在肿瘤得发生和发展中发挥着重要作用。Six1基因可调控细胞周期，诱导细胞增殖、迁移，维持细胞生存，抑制细胞凋亡。在人和小鼠上的大量研究可以看出肌肉的发育和Six1基因有着密切的关系。本实验室先前研究也发现，猪Six1基因在骨骼肌中的表达量要比其它所检测的组织高出很多[2]。因此对Six1基因的启动子进行研究意义重大。Laclef等2003年研究发现，Six1基因敲除鼠表现出全身性的肌肉发育不全[3]，而Six1Six4双基因敲除的鼠也同样表现出普遍的肌肉发育不全，生肌决定因子myogenin与Myod1在肌刀中的表达受到严重损害[4]。进一步的研究表明，Six1基因对生肌决定因子myogenin及Myf5的调控是通过与这些重要因子启动子中的MEF3元件相互作用来实现的[5,6]。更有趣的是，Six1基因还参与了肌纤维形成，可通过调控快肌特异基因的表达来促进慢型肌纤维向快型肌纤维转变[7-8]。肌肉品质差异的一个重要因素就是肌纤维类型的差异，氧化型纤维（I +IIA型）（慢型肌纤维）与肉色、系水力和嫩度等呈正相关，IIB型纤维（快型肌纤维）在肌肉中所占比例的增加有助于肉产量的增加，然而生长速率过快则会直接影响肌肉的品质。可以合理的推断，Six1基因很可能会影响IIB型肌纤维形成，并与猪产肉性能及肌肉品质的有着密切的联系。然而，目前对Six1基因的上游转录调控机制的研究相对较少。本研究采用高通量测序技术对Six1基因启动子，以及第1内含子1595位点的遗传变异位点在皮特兰×杜洛克猪×长白猪×大白猪四元商品猪群，以及2个国猪种大白与长白猪，4个中国地方猪种梅山、二花脸、米猪与沙乌头猪，以及1个合成品种苏淮猪中进行了扫描，其研究结果为深入开展Six1基因的转录调控机制奠定了基础。1 材料与方法 试验材料本研究采用了一个皮特兰×杜洛克猪×长白猪×大白猪四元商品猪群，共计509份样品。2个国猪种大白与长白猪，4个中国地方猪种梅山、二花脸、米猪与沙乌头猪，以及1个合成品种苏淮猪，共计144份样品。1.2 主要仪器与设备超净工作台、台式冷冻离心机、超低温冰箱、DNA纯度浓度微量检测仪（NanoDrop 2000）、-20℃冰箱、普通PCR仪、电泳凝胶成像系统、微波炉、电泳仪、电泳槽、可调式微量移液器、千分之一电子天平、高压消毒锅、摇床、MiSeq Benchtop Sequencer测序仪。1.3 主要试剂耗材氯仿、苯酚、异戊醇、无水乙醇、70%乙醇、DNA聚合酶、灭菌蒸馏水、HindII限制性内切酶、TBE硼酸缓冲液、DNA Marker、核酸染料Godview、琼脂糖、MiSeq Reagent Kit v2，QIAquick Gel Extraction kit、离心管(10 ml、1.5 ml）、各类枪头（20 μl、20 0μl）及。1.4 试验方法1.4.1 DNA提取利用苯酚氯仿法从实验室所收集的猪只耳组织样或肌肉组织样本中抽提基因组DNA，具体方法如下 1）将组织液氮速冻碾碎，置于2ml离心管中。 2）加入900ml裂解液，及30μl蛋白酶K，摇匀。 3）置于55℃水浴锅孵育过夜（加封口膜防水），直至管中无组织样液体清亮。 了4）每管加入等体积（900μl）饱和酚，摇匀器上室温摇匀15分钟，10000转4℃离心10-15分钟。 5）取上清，置于新的2ml离心管中，加500μl饱和酚，500μl氯仿（氯仿异戊醇=24:1），室温混摇15分钟，10000转4℃离心10-15分钟。 6）取上清，置于新的2ml离心管中，加等体积的纯氯仿，室温混摇15分钟，10000转4℃离心10-15分钟。 7）取上清，置于1.5ml离心管中，加入800μl无水乙醇，室温混摇15分钟，10000转4℃离心10-15分钟。 8）弃上清，加入1ml70%的乙醇洗涤，10000转4℃离心10-15分钟。 9）重复步骤8 10)空离2分钟，吸干剩余乙醇，通风处内风干，加灭菌水溶解（提前55℃预热），-20℃保存。1.4.2 DNA检测 对所提取的DNA首先进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，确保基因组DNA没有出现严重的降解；其次，利用NanoDrop 2000对基因组DNA的浓度与纯度进行检测，确保样品的OD 值260/280值在1.8-2.0 之间，260/230值在1.8以上，样品浓度在10ng/μl，总量在300ng以上。1.4.3高通量测序技术鉴定Six1基因目标区域的变异位点（1）根据目标区域序列设计PCR扩增引物，本研究所分析的区域包括Six1基因转录起始位点前2kb，以及第一内含子1595位点进行检测（2）对PCR扩增条件进行优化（3）根据PCR优化体系，以500个皮×杜×长×大F2代资源群个体，以及7个不同种猪共计144个个体DNA样品为模板进行PCR扩增（4）对PCR扩增产物添加特异性标签序列构建目标区段二代测序文库（Fast TargetTM 富集技术）（5）文库质检合格后利用IIIumina ?Miseq 测序仪的2×300bp测序模块对目的片段进行双向测序。1.4.4高通量数据分析使用Varscan GATK, Picard以及SAMtools这些方法以及软件构建的pipeline分析样本中基因的突变位点，其具体包括（1）将SAM文件转换成合适的BAM文件；（2）去除掉mapping文件中的duplicates；（3）针对indel进行局部区域的再定位(local alignment around indels)；（4）重新加权计算碱基质量从而取消测序质量等因素的影响(recalibration of base quality)；（5）寻找突变体(variant calling)。之后对于所产生的突变体进行深入分析，包括突变类型，突变位置和在基因组上的位置以及分类等，这些功能分析运用了ANNOVAR软件。1.4.5高通量数据验证（1）引物设计与PCR扩增根据Six1基因序列，设计针对内含子1595位点的基因分型引物，利用Premier Primer 5.0软件设计合适的可用于猪Six1基因内含子1595处A/G SNPs分型的引物，上下游引物序及扩增信息见表1。表1 基因分型引物Table 1 The primers for genotype基因名称Gene symbols引物名称Primer name引物序列Primer sequences(5’-3’)结合区域Binding region退火温度Annealing Temperature(℃)长度Size(bp)Six1S4FS4RCCGTCCGTCCTTTAAGTCAG AGCACGCATTTAGAAGTCAC Intron 1Intron 160℃329bp以皮×杜×长×大F2代资源群个体，以及7个不同猪种个体DNA为模板进行PCR，PCR反应体系20μl，包括10 μl rTaqDNA聚合酶mix，0.5μl 10mM正反应引物，1μl的DNA为模板（100ng/μl），补灭菌超纯水至20μl。PCR反应条件为94℃预变性4min；94℃变性30s，退火温度见表1，退火时间30s，72℃延伸，延伸时间40s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。 （2）PCR扩增检测以PCR扩增所获得的产物利用1.5%的琼脂糖凝胶进行检测，首先称取1.5克琼脂糖，置于锥形瓶内，加入100 ml 1×TBE，瓶口用保鲜膜封盖，在微波炉中加热直至琼脂糖全部溶解，得到1.5%琼脂糖凝胶液，待其冷却至65℃左右，加入2.5 μl 溴化乙啶贮存液（10 mg/ml），使溴化乙啶终浓度为0.5 μg/ml。小心混匀并倒在有机玻璃内槽中，控制灌胶速度，使胶液缓慢展开，避免产生气泡，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1小时左右，待胶凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。将凝胶放入电泳槽中，加入恰好没过胶面1 mm 深的足够电泳缓冲液，预电泳10 min。每份PCR产物取5μl，加2 μl 6×上样缓冲液，混匀后加入到样品孔中，以100 V 电泳50分钟。（3）PCR产物酶切与基因型鉴定根据Premier Primer 5.0软件分析结果，利用合适的限制性内切酶进行酶切。PCR产物酶切反应体积为10μl，其中1×buffer 1μl，HindII限制性内切酶0.5μl （5U），PCR产物5-8μl（视PCR产物浓度而定），其余补水，将样品混匀后离心，37℃酶切6h以上。酶切产物用2-2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统成像，记录基因型。2 结果与分析2.1 DNA提取凝胶检测结果 图1 DNA提取凝胶检测结果M为10kb Marker，最小条带为1kb，最大条带为10kb.从图1可以看出图中只检测到一条大于10kb的亮带，并未见模糊的拖带，表明所提取的DNA无降解，DNA的完整性较好。另外，在胶孔的周围也未见明显的白色杂物，表明DNA受蛋白污染的程度小。而DNA纯度与浓度的检测结果显示，所提取的DNA纯度值260/280均在1.8-2.0之间，表明所提取的DNA纯度较好，浓度检测结果各样品大小不一，所提交的浓度都在400ng/μl以上，有的达到了2000ng/μl，DNA量完全达到了后续实验的需求。2.2 高通量数据验证结果本研究利用PCR-RFLP方法对Six1基因第1内含 子1595bp变异位点进行检测，以此来验证高通量数据的可靠性。PCR-RFLP酶切分型结果如图2所示。PCR产物长度为329 bp。当该位点为A时，不能被HindII酶切，酶切后只有一个片段，长度为329bp（A等位基因）；当该位点为G时，HindII酶可将PCR产物酶切成两个片段，长度分别为210bp和119bp（G等位基因）。因此，AA基因型只有一条329bp带；GG基因型有210bp和119bp二条带，AG基因型有329bp、210bp和119bp三条带。从500个样品中随机挑取了50个样品进行检测，检测的结果显示，高通量测序分型结果与利用PCR-RFLP的方法所获得的结果完全一致，表明利用高通量测序技术所获得数据结果真实可靠。图2 猪Six1基因内含子1595处突变HindII-RFLP酶切分型结果泳道MDNA分子标准（DL500: 500，400，300，200，150，100和50bp）2.3皮×杜×长×大商品猪群遗传变异数据统计分析通过统计分析，在所分析的皮杜长大商品猪群中共检测到2种遗传变异类型，一种是位于Six1基因第1内含子1595位点的A/G单碱基突变，另外一种是位于Six1基因启动子中微卫星（AC）n变异。表2显示的第1内含子1595位点多态性分析结果，从结果可以看出，在皮杜长大商品猪群中G等位基因占优势，等位基因频率达到了0.79。Six1基因在骨骼肌的生长发育中扮演着十分重要的调控作用，之前的研究已显示该位点在中外猪种中等位基因频率存在明显的差异[6],而中外猪种在生长速度上存在显著差异，这也暗示着该位点可能作为一种分子标记用于种猪辅助选育。值得关注的是，该位点在皮杜长大群体中也存在明显的变异，皮特兰、杜洛克、长白与大白四种瘦肉型猪种，都具有生长快、瘦肉率高的特点，但这些猪种品种内生产性能仍存在一定的分化，本研究结果表明该位点在皮杜长大群体中存在一定的变异，那么该位点是否可作为品种内选育的辅助标记仍值得进一步的研究。表2 Six1基因内含子HindII-RFLP在皮杜长大中的多态性Table 2 Polymorphism of Six1 gene intron HindII-RFLP in different P×D×L×Y pig population品种Breed数量Number基因型与基因型频率Genotype and Genotype frequency等位基因频率Allele frequencyAAAGGGAG皮杜长大Pietrain × Duroc × Landrace × Yorkshire508231653200.2080.792而在该群体中对Six1基因启动子微卫星（AC）n变异统计的结果表明，在该群体中共存在6种基因型，基因频率最高的基因型组合为19/22，其次为22/22，表明在该群体中微卫星（AC）重复为22的个体最多，其次为（AC）重复为19的个体。微卫星（Microsatellite）又称短串联重复序列（Short tandem repeat, STR）或简单重复序列（Simple sequence repeats, SSR），是一种广泛存在于真核与原核生物基因组中，以1-6bp为重复单位串联而成的核苷酸序列[5]。传统的观点认为微卫星与其它的简单重复序列是一类中性标记，不具功能作用，但越来越多的研究证实这种观点带有片面性，发现这些简单重复序列参与了许多的生物学过程，在生物生长发育、表型变异，以及人类疾病的发生中发挥着重要作用[7] 。因此，Six1基因启动子中的微卫星（AC）n是否对Six1基因的转录表达发挥作用仍值得深入研究。表3 Six1基因启动子STR在皮杜长大商品猪群中的多态性Table 3 Polymorphism of Six1 gene promoter STR in P×D×L×Y pig population基因型Genotype样本数Number基因型频率Genotype frequency19/2430.0058939120/22130.02554027519/20340.06679764219/19500.09823182722/221310.25736738719/222780.5461689592.4不同品种中Six1基因遗传变异数据统计分析进一步，本研究对Six1基因启动子及第1内含子1595位点在7个不同猪种，共计144个个体进行了遗传变异位点扫描。检测分析结果显示，在7个不同种猪中共检测到了12个遗传变异位点，包括10个单碱基突变位点，1个插入缺失位点，1个微卫星变异位点。而近年大量的研究表明微卫星在基因的转录表调控中发挥着重要作用，因此，本研究仅对Six1基因启动子微卫星（AC）n变异在不同猪种中的变异情况进行了统计分析，如表4所示。表4 Six1基因启动子STR在不同猪种中的多态性Table 4 Polymorphism of Six1 gene promoter STR in different pig breeds品种类型梅山猪米猪沙乌头猪二花脸猪苏淮猪长白猪大白猪20/221077710022/223710411219/22010065619/19003070720/20513800019/24001020421/22112002019/20002200021/26030000026/26010200020/26110000018/22000001020/25001000022/24000000123/260001000STRShort Tandem Repeat (Microsatellite)统计结果表明，中外猪种在该位点中存在明显的差异，在不同猪种中共检测到了15种基因型，其中中国地方猪种主要以20/22与20/20两种基因型为主，而国外猪种主要以22/22、19/22与19/19三种基因型为主。由于Six1基因是一个骨骼肌生长发育密切相关的转录因子，而骨骼肌生长发育与猪的生长速度有着密切的联系，该微卫星（AC）n在中外猪种中存在明显差异，其是否是影响Six1基因转录表达，进而影响中外猪种生长速度差异关键因素仍值得深入研究。值得关注的是，苏淮猪该微卫星（AC）n的变异位点与大白猪最为相近，这一结果与苏淮猪的培育历史有着密切的联系，苏淮猪是由大白猪与中国地方猪种淮猪长期选育而成的新品种，其血统中50%的是大白猪的血统[8]，因此本研究的结果也从侧面很好的的证实了这一结论。Six1基因作为影响肌肉生长发育的重要调控因子，是一个影响猪生长发育与肌肉品质的重要候选基因，本研究利用高通量测序技术，对该基因启动子中的遗传变异位点进行了全面的扫描，所获得研究结果可为进一步深入开展Six1基因的转录调控奠定了重要基础，特别是启动子中微卫星（AC）n变异更值得深入研究。致谢参考文献[1] Wangjun Wu, Ruihua Huang, Qinghua Wu, Pinghua Li, Jie Chen1, Bojiang Li, Honglin Liu,* The Role of Six1 in the Genesis of Muscle Cell and Skeletal Muscle Development，International Journal of Biological Sciences，10 (9): 983-989, 2014[2] Spitz F, Demignon J, Porteu A et al. Expression of myogenin during embryogenesis is controlled by Six/sine oculis homeoproteins through a conserved MEF3 binding site. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95(24):14220-14225[3] Laclef C, Hamard G, Demignon J et al. Altered myogenesis in Six1-deficient mice. Development, 2003a, 130(10):2239-2252[4] Wangjun Wu, Zhuqing Ren, Yan Wang, Zhe Chao, Dequan Xu, Yuanzhu Xiong*. Molecular characterization, expression patterns and polymorphism analysis of porcine Six1 gene. Molecular Biology Reports, 38 (4): 2619-2632, 2011[5] Toth, G., Z. Gaspari, and J. Jurka, Microsatellites in different eukaryotic genomes: Survey and analysis. Genome Research, 2000. 10(7): p. 967-981.[6] Molecular characterization, expression patterns and polymorphism analysis of porcine Six1 gene[7] Gemayel, R., et al., Variable Tandem Repeats Accelerate Evolution of Coding and Regulatory Sequences. Annual Review of Genetics, Vol 44, 2010. 44: p. 445-477.Hannan, A.J., Tandem repeat polymorphisms: modulators of disease susceptibility and candidates for missing heritability. Trends in Genetics, 2010. 26(2): p. 59-65[8] 于传军，王钧顺，苏淮猪的选育方法总结，畜牧与兽医，43 (11): 10-109, 2011
目录
摘要 1
Abstract 1
引言： 2
1 材料与方法 3
1.1 试验材料 3
1.2 主要仪器与设备 3
1.4 试验方法 3
1.4.1 DNA提取 3
1.4.2 DNA检测 4
1.4.3高通量测序技术鉴定Six1基因目标区域的变异位点 4
1.4.4高通量数据分析 4
1.4.5高通量数据验证 5
2 结果与分析 6
2.1 DNA提取凝胶检测结果 6
2.2 高通量数据验证结果 6
2.3皮×杜×长×大商品猪群遗传变异数据统计分析 7
基因型 8
Genotype 8
基因型频率 8
2.4不同品种中Six1基因遗传变异数据统计分析 8
致谢 9
参考文献 9
猪Six1基因启动子变异位点的筛选及遗传多样性分析
动物科学 文心刚
引言
molecular markers for pig breeding remains a need for further study. This study used high-throughput sequencing technology Six1 gene promoter and intron 1 1595 A genetic mutation sites in Pietrain × Duroc × Landrace × Large White pigs four yuan of goods, as well as two State Yorkshire and Landrace pigs, four Chinese local breeds Meishan, Erhualian, Saudi pig pig and rice, as well as a synthetic varieties Suhuai pigs were scanned, detected a total of 12 sites of genetic variation, including 10 single base mutation sites, an indel sites, as well as a (CA) n microsatellite variation sites. Its promoter in the (CA) n microsatellite Pompidou grew up in Communist groups there are six genotypes, the highest frequency of gene genotype combination 19/22. In the presence of different pig CPC 15 genotypes, Chinese local breeds mainly in the 20/22 and 20/20 genotypes based, while the foreign breeds mainly in 22 / 22,19 / 22 and 19/19 three genes type-based. This study was undertaken to carry out Six1 gene transcriptional regulation mechanism has laid a good foundation.Six基因家族属于Homeobox超基因家族，Six1基因是家族成员之一。Six基因家族的成员都具有一个SD（110-115个氨基酸）与HD（60个氨基酸）结构域，这两个结构区域都具有一个特性就是可以与特异的DNA基序结合。这种特异性结合可以活化或抑制相关靶基因的转录对机体的发育起调控作用。在参与肌肉形成的过程中，Six1蛋白可与肌细胞生成素 (myogenin)启动子上的MEF3元件结合，从而活化这个肌肉决定因子 [1]；缺失Six1基因的小鼠在出生时出现了严重的肋骨畸形而死亡，而身体的大部分肌肉表现出严重的肌肉营养不良，尤其是某些轴下肌肉；Six1Six4双基因敲除的鼠表现为颅面与肋骨缺陷和普遍的肌肉发育不全，生肌决定因子myogenin与Myod1在肌刀中的表达也受到了严重的影响 [2]；2012年，Wu等人克隆了猪Six1基因的完整序，进一步，对Six1基因在猪心、肝、脾、肺、肾、胃、脂肪、肌肉等20个组织了检测，结果表明，猪Six1在骨骼肌中具有最高丰度的表达[3]，暗示着Six1在猪骨骼肌的生长发育中可能发挥着非常关键的作用。在许多研究中我们发现，同源异型盒基因Six1作为转录因子，不但与胚胎细胞发育和器官分化有关，而且在肿瘤得发生和发展中发挥着重要作用。Six1基因可调控细胞周期，诱导细胞增殖、迁移，维持细胞生存，抑制细胞凋亡。在人和小鼠上的大量研究可以看出肌肉的发育和Six1基因有着密切的关系。本实验室先前研究也发现，猪Six1基因在骨骼肌中的表达量要比其它所检测的组织高出很多[2]。因此对Six1基因的启动子进行研究意义重大。Laclef等2003年研究发现，Six1基因敲除鼠表现出全身性的肌肉发育不全[3]，而Six1Six4双基因敲除的鼠也同样表现出普遍的肌肉发育不全，生肌决定因子myogenin与Myod1在肌刀中的表达受到严重损害[4]。进一步的研究表明，Six1基因对生肌决定因子myogenin及Myf5的调控是通过与这些重要因子启动子中的MEF3元件相互作用来实现的[5,6]。更有趣的是，Six1基因还参与了肌纤维形成，可通过调控快肌特异基因的表达来促进慢型肌纤维向快型肌纤维转变[7-8]。肌肉品质差异的一个重要因素就是肌纤维类型的差异，氧化型纤维（I +IIA型）（慢型肌纤维）与肉色、系水力和嫩度等呈正相关，IIB型纤维（快型肌纤维）在肌肉中所占比例的增加有助于肉产量的增加，然而生长速率过快则会直接影响肌肉的品质。可以合理的推断，Six1基因很可能会影响IIB型肌纤维形成，并与猪产肉性能及肌肉品质的有着密切的联系。然而，目前对Six1基因的上游转录调控机制的研究相对较少。本研究采用高通量测序技术对Six1基因启动子，以及第1内含子1595位点的遗传变异位点在皮特兰×杜洛克猪×长白猪×大白猪四元商品猪群，以及2个国猪种大白与长白猪，4个中国地方猪种梅山、二花脸、米猪与沙乌头猪，以及1个合成品种苏淮猪中进行了扫描，其研究结果为深入开展Six1基因的转录调控机制奠定了基础。1 材料与方法 试验材料本研究采用了一个皮特兰×杜洛克猪×长白猪×大白猪四元商品猪群，共计509份样品。2个国猪种大白与长白猪，4个中国地方猪种梅山、二花脸、米猪与沙乌头猪，以及1个合成品种苏淮猪，共计144份样品。1.2 主要仪器与设备超净工作台、台式冷冻离心机、超低温冰箱、DNA纯度浓度微量检测仪（NanoDrop 2000）、-20℃冰箱、普通PCR仪、电泳凝胶成像系统、微波炉、电泳仪、电泳槽、可调式微量移液器、千分之一电子天平、高压消毒锅、摇床、MiSeq Benchtop Sequencer测序仪。1.3 主要试剂耗材氯仿、苯酚、异戊醇、无水乙醇、70%乙醇、DNA聚合酶、灭菌蒸馏水、HindII限制性内切酶、TBE硼酸缓冲液、DNA Marker、核酸染料Godview、琼脂糖、MiSeq Reagent Kit v2，QIAquick Gel Extraction kit、离心管(10 ml、1.5 ml）、各类枪头（20 μl、20 0μl）及。1.4 试验方法1.4.1 DNA提取利用苯酚氯仿法从实验室所收集的猪只耳组织样或肌肉组织样本中抽提基因组DNA，具体方法如下 1）将组织液氮速冻碾碎，置于2ml离心管中。 2）加入900ml裂解液，及30μl蛋白酶K，摇匀。 3）置于55℃水浴锅孵育过夜（加封口膜防水），直至管中无组织样液体清亮。 了4）每管加入等体积（900μl）饱和酚，摇匀器上室温摇匀15分钟，10000转4℃离心10-15分钟。 5）取上清，置于新的2ml离心管中，加500μl饱和酚，500μl氯仿（氯仿异戊醇=24:1），室温混摇15分钟，10000转4℃离心10-15分钟。 6）取上清，置于新的2ml离心管中，加等体积的纯氯仿，室温混摇15分钟，10000转4℃离心10-15分钟。 7）取上清，置于1.5ml离心管中，加入800μl无水乙醇，室温混摇15分钟，10000转4℃离心10-15分钟。 8）弃上清，加入1ml70%的乙醇洗涤，10000转4℃离心10-15分钟。 9）重复步骤8 10)空离2分钟，吸干剩余乙醇，通风处内风干，加灭菌水溶解（提前55℃预热），-20℃保存。1.4.2 DNA检测 对所提取的DNA首先进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，确保基因组DNA没有出现严重的降解；其次，利用NanoDrop 2000对基因组DNA的浓度与纯度进行检测，确保样品的OD 值260/280值在1.8-2.0 之间，260/230值在1.8以上，样品浓度在10ng/μl，总量在300ng以上。1.4.3高通量测序技术鉴定Six1基因目标区域的变异位点（1）根据目标区域序列设计PCR扩增引物，本研究所分析的区域包括Six1基因转录起始位点前2kb，以及第一内含子1595位点进行检测（2）对PCR扩增条件进行优化（3）根据PCR优化体系，以500个皮×杜×长×大F2代资源群个体，以及7个不同种猪共计144个个体DNA样品为模板进行PCR扩增（4）对PCR扩增产物添加特异性标签序列构建目标区段二代测序文库（Fast TargetTM 富集技术）（5）文库质检合格后利用IIIumina ?Miseq 测序仪的2×300bp测序模块对目的片段进行双向测序。1.4.4高通量数据分析使用Varscan GATK, Picard以及SAMtools这些方法以及软件构建的pipeline分析样本中基因的突变位点，其具体包括（1）将SAM文件转换成合适的BAM文件；（2）去除掉mapping文件中的duplicates；（3）针对indel进行局部区域的再定位(local alignment around indels)；（4）重新加权计算碱基质量从而取消测序质量等因素的影响(recalibration of base quality)；（5）寻找突变体(variant calling)。之后对于所产生的突变体进行深入分析，包括突变类型，突变位置和在基因组上的位置以及分类等，这些功能分析运用了ANNOVAR软件。1.4.5高通量数据验证（1）引物设计与PCR扩增根据Six1基因序列，设计针对内含子1595位点的基因分型引物，利用Premier Primer 5.0软件设计合适的可用于猪Six1基因内含子1595处A/G SNPs分型的引物，上下游引物序及扩增信息见表1。表1 基因分型引物Table 1 The primers for genotype基因名称Gene symbols引物名称Primer name引物序列Primer sequences(5’-3’)结合区域Binding region退火温度Annealing Temperature(℃)长度Size(bp)Six1S4FS4RCCGTCCGTCCTTTAAGTCAG AGCACGCATTTAGAAGTCAC Intron 1Intron 160℃329bp以皮×杜×长×大F2代资源群个体，以及7个不同猪种个体DNA为模板进行PCR，PCR反应体系20μl，包括10 μl rTaqDNA聚合酶mix，0.5μl 10mM正反应引物，1μl的DNA为模板（100ng/μl），补灭菌超纯水至20μl。PCR反应条件为94℃预变性4min；94℃变性30s，退火温度见表1，退火时间30s，72℃延伸，延伸时间40s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。 （2）PCR扩增检测以PCR扩增所获得的产物利用1.5%的琼脂糖凝胶进行检测，首先称取1.5克琼脂糖，置于锥形瓶内，加入100 ml 1×TBE，瓶口用保鲜膜封盖，在微波炉中加热直至琼脂糖全部溶解，得到1.5%琼脂糖凝胶液，待其冷却至65℃左右，加入2.5 μl 溴化乙啶贮存液（10 mg/ml），使溴化乙啶终浓度为0.5 μg/ml。小心混匀并倒在有机玻璃内槽中，控制灌胶速度，使胶液缓慢展开，避免产生气泡，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。室温下静置1小时左右，待胶凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的样品槽。将凝胶放入电泳槽中，加入恰好没过胶面1 mm 深的足够电泳缓冲液，预电泳10 min。每份PCR产物取5μl，加2 μl 6×上样缓冲液，混匀后加入到样品孔中，以100 V 电泳50分钟。（3）PCR产物酶切与基因型鉴定根据Premier Primer 5.0软件分析结果，利用合适的限制性内切酶进行酶切。PCR产物酶切反应体积为10μl，其中1×buffer 1μl，HindII限制性内切酶0.5μl （5U），PCR产物5-8μl（视PCR产物浓度而定），其余补水，将样品混匀后离心，37℃酶切6h以上。酶切产物用2-2.5%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统成像，记录基因型。2 结果与分析2.1 DNA提取凝胶检测结果 图1 DNA提取凝胶检测结果M为10kb Marker，最小条带为1kb，最大条带为10kb.从图1可以看出图中只检测到一条大于10kb的亮带，并未见模糊的拖带，表明所提取的DNA无降解，DNA的完整性较好。另外，在胶孔的周围也未见明显的白色杂物，表明DNA受蛋白污染的程度小。而DNA纯度与浓度的检测结果显示，所提取的DNA纯度值260/280均在1.8-2.0之间，表明所提取的DNA纯度较好，浓度检测结果各样品大小不一，所提交的浓度都在400ng/μl以上，有的达到了2000ng/μl，DNA量完全达到了后续实验的需求。2.2 高通量数据验证结果本研究利用PCR-RFLP方法对Six1基因第1内含 子1595bp变异位点进行检测，以此来验证高通量数据的可靠性。PCR-RFLP酶切分型结果如图2所示。PCR产物长度为329 bp。当该位点为A时，不能被HindII酶切，酶切后只有一个片段，长度为329bp（A等位基因）；当该位点为G时，HindII酶可将PCR产物酶切成两个片段，长度分别为210bp和119bp（G等位基因）。因此，AA基因型只有一条329bp带；GG基因型有210bp和119bp二条带，AG基因型有329bp、210bp和119bp三条带。从500个样品中随机挑取了50个样品进行检测，检测的结果显示，高通量测序分型结果与利用PCR-RFLP的方法所获得的结果完全一致，表明利用高通量测序技术所获得数据结果真实可靠。图2 猪Six1基因内含子1595处突变HindII-RFLP酶切分型结果泳道MDNA分子标准（DL500: 500，400，300，200，150，100和50bp）2.3皮×杜×长×大商品猪群遗传变异数据统计分析通过统计分析，在所分析的皮杜长大商品猪群中共检测到2种遗传变异类型，一种是位于Six1基因第1内含子1595位点的A/G单碱基突变，另外一种是位于Six1基因启动子中微卫星（AC）n变异。表2显示的第1内含子1595位点多态性分析结果，从结果可以看出，在皮杜长大商品猪群中G等位基因占优势，等位基因频率达到了0.79。Six1基因在骨骼肌的生长发育中扮演着十分重要的调控作用，之前的研究已显示该位点在中外猪种中等位基因频率存在明显的差异[6],而中外猪种在生长速度上存在显著差异，这也暗示着该位点可能作为一种分子标记用于种猪辅助选育。值得关注的是，该位点在皮杜长大群体中也存在明显的变异，皮特兰、杜洛克、长白与大白四种瘦肉型猪种，都具有生长快、瘦肉率高的特点，但这些猪种品种内生产性能仍存在一定的分化，本研究结果表明该位点在皮杜长大群体中存在一定的变异，那么该位点是否可作为品种内选育的辅助标记仍值得进一步的研究。表2 Six1基因内含子HindII-RFLP在皮杜长大中的多态性Table 2 Polymorphism of Six1 gene intron HindII-RFLP in different P×D×L×Y pig population品种Breed数量Number基因型与基因型频率Genotype and Genotype frequency等位基因频率Allele frequencyAAAGGGAG皮杜长大Pietrain × Duroc × Landrace × Yorkshire508231653200.2080.792而在该群体中对Six1基因启动子微卫星（AC）n变异统计的结果表明，在该群体中共存在6种基因型，基因频率最高的基因型组合为19/22，其次为22/22，表明在该群体中微卫星（AC）重复为22的个体最多，其次为（AC）重复为19的个体。微卫星（Microsatellite）又称短串联重复序列（Short tandem repeat, STR）或简单重复序列（Simple sequence repeats, SSR），是一种广泛存在于真核与原核生物基因组中，以1-6bp为重复单位串联而成的核苷酸序列[5]。传统的观点认为微卫星与其它的简单重复序列是一类中性标记，不具功能作用，但越来越多的研究证实这种观点带有片面性，发现这些简单重复序列参与了许多的生物学过程，在生物生长发育、表型变异，以及人类疾病的发生中发挥着重要作用[7] 。因此，Six1基因启动子中的微卫星（AC）n是否对Six1基因的转录表达发挥作用仍值得深入研究。表3 Six1基因启动子STR在皮杜长大商品猪群中的多态性Table 3 Polymorphism of Six1 gene promoter STR in P×D×L×Y pig population基因型Genotype样本数Number基因型频率Genotype frequency19/2430.0058939120/22130.02554027519/20340.06679764219/19500.09823182722/221310.25736738719/222780.5461689592.4不同品种中Six1基因遗传变异数据统计分析进一步，本研究对Six1基因启动子及第1内含子1595位点在7个不同猪种，共计144个个体进行了遗传变异位点扫描。检测分析结果显示，在7个不同种猪中共检测到了12个遗传变异位点，包括10个单碱基突变位点，1个插入缺失位点，1个微卫星变异位点。而近年大量的研究表明微卫星在基因的转录表调控中发挥着重要作用，因此，本研究仅对Six1基因启动子微卫星（AC）n变异在不同猪种中的变异情况进行了统计分析，如表4所示。表4 Six1基因启动子STR在不同猪种中的多态性Table 4 Polymorphism of Six1 gene promoter STR in different pig breeds品种类型梅山猪米猪沙乌头猪二花脸猪苏淮猪长白猪大白猪20/221077710022/223710411219/22010065619/19003070720/20513800019/24001020421/22112002019/20002200021/26030000026/26010200020/26110000018/22000001020/25001000022/24000000123/260001000STRShort Tandem Repeat (Microsatellite)统计结果表明，中外猪种在该位点中存在明显的差异，在不同猪种中共检测到了15种基因型，其中中国地方猪种主要以20/22与20/20两种基因型为主，而国外猪种主要以22/22、19/22与19/19三种基因型为主。由于Six1基因是一个骨骼肌生长发育密切相关的转录因子，而骨骼肌生长发育与猪的生长速度有着密切的联系，该微卫星（AC）n在中外猪种中存在明显差异，其是否是影响Six1基因转录表达，进而影响中外猪种生长速度差异关键因素仍值得深入研究。值得关注的是，苏淮猪该微卫星（AC）n的变异位点与大白猪最为相近，这一结果与苏淮猪的培育历史有着密切的联系，苏淮猪是由大白猪与中国地方猪种淮猪长期选育而成的新品种，其血统中50%的是大白猪的血统[8]，因此本研究的结果也从侧面很好的的证实了这一结论。Six1基因作为影响肌肉生长发育的重要调控因子，是一个影响猪生长发育与肌肉品质的重要候选基因，本研究利用高通量测序技术，对该基因启动子中的遗传变异位点进行了全面的扫描，所获得研究结果可为进一步深入开展Six1基因的转录调控奠定了重要基础，特别是启动子中微卫星（AC）n变异更值得深入研究。致谢参考文献[1] Wangjun Wu, Ruihua Huang, Qinghua Wu, Pinghua Li, Jie Chen1, Bojiang Li, Honglin Liu,* The Role of Six1 in the Genesis of Muscle Cell and Skeletal Muscle Development，International Journal of Biological Sciences，10 (9): 983-989, 2014[2] Spitz F, Demignon J, Porteu A et al. Expression of myogenin during embryogenesis is controlled by Six/sine oculis homeoproteins through a conserved MEF3 binding site. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95(24):14220-14225[3] Laclef C, Hamard G, Demignon J et al. Altered myogenesis in Six1-deficient mice. Development, 2003a, 130(10):2239-2252[4] Wangjun Wu, Zhuqing Ren, Yan Wang, Zhe Chao, Dequan Xu, Yuanzhu Xiong*. Molecular characterization, expression patterns and polymorphism analysis of porcine Six1 gene. Molecular Biology Reports, 38 (4): 2619-2632, 2011[5] Toth, G., Z. Gaspari, and J. Jurka, Microsatellites in different eukaryotic genomes: Survey and analysis. Genome Research, 2000. 10(7): p. 967-981.[6] Molecular characterization, expression patterns and polymorphism analysis of porcine Six1 gene[7] Gemayel, R., et al., Variable Tandem Repeats Accelerate Evolution of Coding and Regulatory Sequences. Annual Review of Genetics, Vol 44, 2010. 44: p. 445-477.Hannan, A.J., Tandem repeat polymorphisms: modulators of disease susceptibility and candidates for missing heritability. Trends in Genetics, 2010. 26(2): p. 59-65[8] 于传军，王钧顺，苏淮猪的选育方法总结，畜牧与兽医，43 (11): 10-109, 2011
目录
摘要 1
Abstract 1
引言： 2
1 材料与方法 3
1.1 试验材料 3
1.2 主要仪器与设备 3
1.4 试验方法 3
1.4.1 DNA提取 3
1.4.2 DNA检测 4
1.4.3高通量测序技术鉴定Six1基因目标区域的变异位点 4
1.4.4高通量数据分析 4
1.4.5高通量数据验证 5
2 结果与分析 6
2.1 DNA提取凝胶检测结果 6
2.2 高通量数据验证结果 6
2.3皮×杜×长×大商品猪群遗传变异数据统计分析 7
基因型 8
Genotype 8
基因型频率 8
2.4不同品种中Six1基因遗传变异数据统计分析 8
致谢 9
参考文献 9
猪Six1基因启动子变异位点的筛选及遗传多样性分析
动物科学 文心刚
引言
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