猪细小病毒sybrgreenⅰ荧光定量pcr检测方法的建立
猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV），主要造成血清学阴性的初产母猪流产、不孕、产死胎、畸形胎、木乃伊胎和弱仔等，是导致全球集约化养猪业经济损失的一个重要原因。本研究，根据Gen Bank上收录的猪细小病毒的NS1基因的特异性核酸序列设计引物，PCR反应后得到265bp的片段，将扩增产物与pMD19-T载体连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑选阳性单克隆子，提取重组质粒，测序鉴定后测其浓度，作为标准模板，得到R2=0.9923的标准曲线。扩增产物的溶解曲线中只有一个特异峰，说明没有引物二聚体，特异性好。病毒的最低检出量为500（copies/μL）。批内实验和批间实验的变异率均低于4%，表明该方法具有较好的稳定性和重复性。本实验为疑似病例的快速诊断及病毒的定量分析提供了简便有效的方法，为PPV的流行病学监测和管理提供了便利。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Keyword 2
引言 2
1 材料与方法 3
1.1主要的仪器与试剂 3
1.1.1主要仪器 3
1.1.2主要试剂 4
1.2方法 4
1.2.1毒株 4
1.2.2引物设计 4
1.2.3 病毒核酸的提取 4
1.2.4 PPV NS1目的基因的扩增 4
1.2.5 PPV胶回收产物与pMD19T载体的连接 6
1.2.6连接产物转化到DH5α感受态细胞 6
1.2.7 PPV标准品的制备及标准曲线的制作 7
1.2.8 PPV特异性检验 8
1.2.9 PPV敏感性的检验 8
1.2.10 PPV重复性的检验 8
2 结果与分析 8
2.1 PPV特异性引物扩增结果 8
2.3 PPV重组质粒测序结果 8
2.4 PPV SYBR Green I荧光定量PCR标准曲线 8
2.5 PPV 特异性实验结果 10
2.6 PPV 敏感性实验结果 11
2.7 PPV 重复性实验结果 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
11
3 讨论 12
致谢 12
参考文献 13
猪细小病毒SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立
引言
猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）为细小病毒科的细小病毒属。病毒粒子为二十面体对称结构，外观为圆形或六边形，大小约为20nm。病毒衣壳含有32个壳粒，有23种衣壳蛋白，无囊膜。病毒基因组为单股线状DNA，大小仅为5000bp。猪细小病毒病是危害母猪繁殖的主要疾病之一，主要引起血清学阴性的初产母猪流产、不孕、产死胎、畸形胎、木乃伊胎和弱仔等，是导致全球集约化养猪业经济损失的一个重要原因。此外还能引起仔猪的皮炎和腹泻，其它类型的猪感染后无明显临床症状[1]。目前研究得知，猪细小病毒只感染猪，不同品种，年龄和性别的猪都对其敏感，一旦感染，终身带毒。猪细小病毒在猪群中检出率甚高,在猪群中的血清抗体阳性率达50%80%[2]。该病在我国多发于410月，猪群中一旦出现PPV，全场猪仔短时间内即可感染本病。感染PPV的猪在一周内会出现病毒血症，37d便可经粪便排毒，1星期后可检测到相应抗体。受病毒侵袭的母猪是该病的重要传染源，其子宫分泌物、死产胎儿、木乃伊胎、仔猪的含毒量巨大。研究表明，子宫内感染还可能产生免疫耐受猪，这类仔猪没有相应的PPV抗体，但可终身带毒排毒。感染公猪也可作为PPV的机械传播者，病毒可入侵睾丸、阴囊、精索、附睾，在交配时经精液或生殖道传播给母猪。
猪细小病毒病经典的诊断方法为无菌采集疑似病例所产死胎、木乃伊胎的肝脏和淋巴结，进行适当处理后，将处理液接种于长成50%单层的PK15细胞，使其与细胞密切接触，加入10%的FBS，放置于37℃，5%CO2培养箱中培养，每天观察细胞病变（CPE）。若细胞出现变圆、固缩、溶解并出现散在的核内包涵体即可判定为阳性感染[3]。然而该方法不但费时、费力、且易受到污染。血凝和血凝抑制（HAHI）实验是目前广泛应用于临床的PPV诊断方法，不需要依赖专用仪器设备，简单易行，且灵敏度高，但也有一些不足之处。例如，实验中所需的红细胞目前最多只能保存1周,需要随用随配，检测血清的处理过程也比较复杂。ELISA是对该病进行流行病学监测和管理最常用的方法，Kong 等采用昆虫杆状病毒表达系统，表达了VP2 蛋白，创立了拥有较高敏感性和特异性的PPV抗体检测 r VPELISA方法[4]。病毒中和实验、免疫荧光技术、单克隆抗体技术等，近年来发展迅速，但也存在操作复杂、成本高、特异性不强等不足之处。随着分子生物学的快速发展，普通PCR有了很大的改进，但存在漏检和交叉污染的现象[5]。
实时荧光定量 PCR技术由美国的Applied Biosystems 公司于1996年率先提出。实时荧光定量PCR是在普通PCR的基础上，将荧光染料或荧光基团添加到体系中，通过荧光信号的积累实时观测整个反应过程。最终使用标准曲线对样本中的核酸浓度做定量分析[6]。SYBR Green I是一种被绿光激发后可以发出荧光信号的染料，能与DNA双螺旋的小沟区域非特异性的结合。在非结合情况下，SYBR Green I产生的荧光信号较微小，当与双链DNA结合后，荧光信号强度增加。因此，当DNA双链的数量越多，SYBR Green I的荧光信号强度也越强。荧光信号强弱的变化就可以直接反映出体系中模板的含量。该方法的灵敏度、特异性均强于经典的方法，而且还具有操作简单、定量分析的优点[7, 8]。本研究利用SYBR Green I染料，建立一种快速高效诊断PPV的方法，为猪病流行的管理和监测提供便利。
1 材料与方法
1.1主要的仪器与试剂
1.1.1主要仪器
超净工作台，购于AIRTECH；PCR仪，购于TAKARA；离心机，购于Eppendorf；电子天平，购于良平仪器；涡旋混合器（MXS），购于SCILOGEX；微波炉，购于Galanz；电泳仪，购于南京麦高德生物科技有限公司；超微量移液器（2.5 μL，10 μL，100 μL，200 μL，1000 μL），购于Eppendorf；紫外分析仪，购于南京麦高德生物科技有限公司；电热恒温水槽（DK8D），购于上海恒科技有限公司；连接仪，购于南京沃拓仪器设备有限公司；HZ9211KB恒温振荡器，购于太仓市华利达实验设备有限公司。7300 Real time PCR system，购自Applied Biosystems；超纯水生成仪，购自优普公司。
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract 2
Keyword 2
引言 2
1 材料与方法 3
1.1主要的仪器与试剂 3
1.1.1主要仪器 3
1.1.2主要试剂 4
1.2方法 4
1.2.1毒株 4
1.2.2引物设计 4
1.2.3 病毒核酸的提取 4
1.2.4 PPV NS1目的基因的扩增 4
1.2.5 PPV胶回收产物与pMD19T载体的连接 6
1.2.6连接产物转化到DH5α感受态细胞 6
1.2.7 PPV标准品的制备及标准曲线的制作 7
1.2.8 PPV特异性检验 8
1.2.9 PPV敏感性的检验 8
1.2.10 PPV重复性的检验 8
2 结果与分析 8
2.1 PPV特异性引物扩增结果 8
2.3 PPV重组质粒测序结果 8
2.4 PPV SYBR Green I荧光定量PCR标准曲线 8
2.5 PPV 特异性实验结果 10
2.6 PPV 敏感性实验结果 11
2.7 PPV 重复性实验结果 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
11
3 讨论 12
致谢 12
参考文献 13
猪细小病毒SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立
引言
猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）为细小病毒科的细小病毒属。病毒粒子为二十面体对称结构，外观为圆形或六边形，大小约为20nm。病毒衣壳含有32个壳粒，有23种衣壳蛋白，无囊膜。病毒基因组为单股线状DNA，大小仅为5000bp。猪细小病毒病是危害母猪繁殖的主要疾病之一，主要引起血清学阴性的初产母猪流产、不孕、产死胎、畸形胎、木乃伊胎和弱仔等，是导致全球集约化养猪业经济损失的一个重要原因。此外还能引起仔猪的皮炎和腹泻，其它类型的猪感染后无明显临床症状[1]。目前研究得知，猪细小病毒只感染猪，不同品种，年龄和性别的猪都对其敏感，一旦感染，终身带毒。猪细小病毒在猪群中检出率甚高,在猪群中的血清抗体阳性率达50%80%[2]。该病在我国多发于410月，猪群中一旦出现PPV，全场猪仔短时间内即可感染本病。感染PPV的猪在一周内会出现病毒血症，37d便可经粪便排毒，1星期后可检测到相应抗体。受病毒侵袭的母猪是该病的重要传染源，其子宫分泌物、死产胎儿、木乃伊胎、仔猪的含毒量巨大。研究表明，子宫内感染还可能产生免疫耐受猪，这类仔猪没有相应的PPV抗体，但可终身带毒排毒。感染公猪也可作为PPV的机械传播者，病毒可入侵睾丸、阴囊、精索、附睾，在交配时经精液或生殖道传播给母猪。
猪细小病毒病经典的诊断方法为无菌采集疑似病例所产死胎、木乃伊胎的肝脏和淋巴结，进行适当处理后，将处理液接种于长成50%单层的PK15细胞，使其与细胞密切接触，加入10%的FBS，放置于37℃，5%CO2培养箱中培养，每天观察细胞病变（CPE）。若细胞出现变圆、固缩、溶解并出现散在的核内包涵体即可判定为阳性感染[3]。然而该方法不但费时、费力、且易受到污染。血凝和血凝抑制（HAHI）实验是目前广泛应用于临床的PPV诊断方法，不需要依赖专用仪器设备，简单易行，且灵敏度高，但也有一些不足之处。例如，实验中所需的红细胞目前最多只能保存1周,需要随用随配，检测血清的处理过程也比较复杂。ELISA是对该病进行流行病学监测和管理最常用的方法，Kong 等采用昆虫杆状病毒表达系统，表达了VP2 蛋白，创立了拥有较高敏感性和特异性的PPV抗体检测 r VPELISA方法[4]。病毒中和实验、免疫荧光技术、单克隆抗体技术等，近年来发展迅速，但也存在操作复杂、成本高、特异性不强等不足之处。随着分子生物学的快速发展，普通PCR有了很大的改进，但存在漏检和交叉污染的现象[5]。
实时荧光定量 PCR技术由美国的Applied Biosystems 公司于1996年率先提出。实时荧光定量PCR是在普通PCR的基础上，将荧光染料或荧光基团添加到体系中，通过荧光信号的积累实时观测整个反应过程。最终使用标准曲线对样本中的核酸浓度做定量分析[6]。SYBR Green I是一种被绿光激发后可以发出荧光信号的染料，能与DNA双螺旋的小沟区域非特异性的结合。在非结合情况下，SYBR Green I产生的荧光信号较微小，当与双链DNA结合后，荧光信号强度增加。因此，当DNA双链的数量越多，SYBR Green I的荧光信号强度也越强。荧光信号强弱的变化就可以直接反映出体系中模板的含量。该方法的灵敏度、特异性均强于经典的方法，而且还具有操作简单、定量分析的优点[7, 8]。本研究利用SYBR Green I染料，建立一种快速高效诊断PPV的方法，为猪病流行的管理和监测提供便利。
1 材料与方法
1.1主要的仪器与试剂
1.1.1主要仪器
超净工作台，购于AIRTECH；PCR仪，购于TAKARA；离心机，购于Eppendorf；电子天平，购于良平仪器；涡旋混合器（MXS），购于SCILOGEX；微波炉，购于Galanz；电泳仪，购于南京麦高德生物科技有限公司；超微量移液器（2.5 μL，10 μL，100 μL，200 μL，1000 μL），购于Eppendorf；紫外分析仪，购于南京麦高德生物科技有限公司；电热恒温水槽（DK8D），购于上海恒科技有限公司；连接仪，购于南京沃拓仪器设备有限公司；HZ9211KB恒温振荡器，购于太仓市华利达实验设备有限公司。7300 Real time PCR system，购自Applied Biosystems；超纯水生成仪，购自优普公司。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/289.html
