结肠癌细胞胞内代谢物提取方法的优化研究
结肠癌细胞胞内代谢物提取方法的优化研究[20200507184421]
摘要：代谢组学是对某一生物或细胞在一特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门新学科。在代谢组学的研究中，如何高效的提取细胞胞内代谢物是一项重要技术。本实验利用SW480结肠癌细胞株，通过改变、调控细胞淬灭过程中溶液种类和浓度梯度以及抽提过程中抽提溶液成分,并结合GC-TOFMS分析以优化结肠癌细胞胞内代谢物提取方法。结果表明，在淬灭过程中甲醇浓度为50%或者75%且不使用碳酸氢铵缓冲液，而在抽提过程中使用乙腈:甲醇:水为40:40:20的混合液，能更加全面地提取各代谢通路中的重要代谢物。
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关键字:代谢组学；结肠癌细胞；胞内代谢物；提取方法
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
1 引言2
2 材料与方法3
2.1 细胞培养 3
2.2 细胞淬灭与抽提3
2.3 细胞样本GC-TOFMS分析前处理工作4
2.4 GC-TOFMS分析4
2.5 GC-TOFMS数据分析4
2.5.1 奇异值校正4
2.5.2 归一化校正4
2.5.3 多元统计分析4
3 结果与讨论4
3.1 结果 4
3.2 讨论 7
4 结论8
致谢8
参考文献9
结肠癌细胞胞内代谢物提取方法的优化研究
引言
1 引言
在蛋白组学和转录组学技术成熟的今天，致力于机体代谢物高通量测量的代谢组学发展相对落后。而基于代谢物水平是所有调控的最终产物的事实，与蛋白组学和转录组学相比，代谢组学能更好地代表细胞表现型[1]。因此，突破代谢组学发展中出现的技术壁垒，优化现有实验条件是十分必要的。
在代谢组学的研究中，如何高效的提取细胞胞内代谢物是一项重要技术，因细胞内酶系活跃、代谢转换迅速, 取样和样品制备方法显著影响分析结果的准确性、重复性。因此, 做好样品的前处理是取得可靠分析结果的先决条件[2]。而传统方法限制了细胞胞内代谢物提取的质量和数量，如胰蛋白酶消化法作为胞内酶淬灭过程中的一种传统方法十分常见，用于消化细胞使其脱离培养基表面，但因改变了细胞外基质而使细胞机能发生改变，从而使细胞代谢物产生了不可逆的转变，因而使胞内代谢物的提取质量劣化。
国外对于胞内代谢物的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
提取方法的优化时有报道。09年Christopher A. Sellick[3]等利用中国仓鼠卵巢重组细胞Super-CHO为研究对象，在对比一系列胞内酶淬灭条件后，得出了60%的甲醇和0.85%的碳酸氢铵在-40℃条件下淬灭能产生具有生理代表性的胞内代谢物的结论。同年，Quincy Teng[4]等亦用乳腺癌细胞进行了细胞淬灭条件的优化，用甲醇代替了胰蛋白酶作为胞内酶淬灭剂，并用核磁共振分析证明新方法能比传统方法能更有效地保留50倍左右的细胞胞内代谢物，是一种更快速高效的方法。在此基础上，Anders P.H. Danielsson[5]等在-80℃的温度条件下，用甲醇提取了大鼠胰岛瘤细胞胞内代谢物。08年Jie Yuan[6]等在大肠杆菌代谢动力学通量分析中，于对比7种不同溶剂后，得出乙腈:甲醇:水为40:40:20的混合液的能最大程度地提取胞内代谢物。10年Stefanie Dietmair[7]等以中国仓鼠卵巢重组细胞Super-CHO为研究对象，采用12种不同的方法抽提其胞内代谢物，发现50%的含水乙腈抽提效果最佳。
近年来国内对胞内代谢物的抽提方法的研究也有了较快的发展。11年梅辉[8]等分别使用冷甲醇法、热乙醇法、甲醇/ 氯仿法、热甲醇法和高氯酸法提取大肠杆菌代谢物，发现冷甲醇法所得到的相对提取率最高, 且重复性好。同年，代海洋[9]等培养获取人脐带间充质干细胞，利用高氯酸(perchloric acid,PCA)提取细胞水溶性代谢物，利用甲醇/氯仿(methanol-chloroform, M/C)提取细胞脂溶性代谢物，并使用甲醇/氯仿/水一次性提取方法(dual phase extraction,DPE)同时获取两种组分，发现PCA对水溶性代谢物具有更高的提取效率，M/C对脂溶性代谢物具有更高的提取效率。13年余欣尉[10]等在肺癌细胞代谢组学分析时，使用液氮淬灭和二氯甲烷为溶剂进行抽提。
本研究在前人研究的基础之上，再进一步予以优化，利用SW480结肠癌细胞株，以淬灭过程中的甲醇溶液浓度(浓度梯度分别为50%、75%、100%)和碳酸氢铵溶液浓度(浓度分别为0.85%或不加)，以及抽提过程中的溶液成分(分为50%水相乙腈和乙腈:甲醇:水为40:40:20的混合液)的不同作为变量并经GC-TOFMS分析以优化结肠癌细胞胞内代谢物提取方法，提高胞内代谢物提取的质量与数量，即提取更高浓度更优质的细胞胞内代谢物，以为后续科研工作提供更科学的实验材料和更准确的实验数据。
2 材料与方法
2．1 细胞培养
用含10%胎牛血清的DMEM培养基在含5% CO2?、37 °C的湿润条件下于细胞培养箱内恒温无菌培养SW480结肠癌细胞。
2．2 细胞淬灭与抽提
细胞淬灭与抽提的溶液成分见表1。具体方法如下：用0.9%(w/v) NaCl水溶液轻轻冲洗去细胞培养瓶中的培养基（细胞数量约为5×106个/瓶），清洗中NaCl溶液也要倒掉，清洗过程重复2-3次。向每个培养瓶中加入5mL淬灭液，冰浴5min。用一次性细胞刮刮下细胞，将所有液体倒入15mL离心管中。加入1mL抽提液，冰浴环境下用超声细胞破碎仪破碎细胞（美国SONICS VC255型超声细胞破碎仪，设定程序为“超声2s-停止3s”循环10min）。将剩余溶液分装到多个2mL离心管中（ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
1.8mL/管），12000rpm离心15min（德国Eppendorf 5415R型冷冻离心机）。取上清液1.5mL至新的2mL离心管中，标记，-80℃保存。
表1. SW480结肠癌细胞胞内代谢物提取方法一览表
Table 1. Extraction method of intracellular metabolites of SW480 colon cancer cells
方法 淬灭过程 抽提过程
甲醇溶液浓度(v/v) 碳酸氢铵溶液浓度(w/v) 抽提液成分
No.1 50% 不加 溶液2
No.2 75% 0.85% 溶液1
No.3 100% 不加 溶液1
No.4 75% 不加 溶液2
No.5 50% 0.85% 溶液1
No.6 100% 0.85% 溶液2
No.7 50% 0.85% 溶液2
No.8 50% 不加 溶液1
No.9 0.9%NaCl (w/v) 溶液1
No.10 0.9%NaCl (w/v) 溶液2
注：溶液1为50%水相乙腈、溶液2为乙腈:甲醇:水为40:40:20的混合液。所有方法的温度条件为4℃。
2．3 细胞样本GC-TOFMS分析前处理工作
取出1.5mL样本，真空旋转干燥至完全干燥，加入150μL超纯水（美国Milli-Q Advantage超纯水系统）。每个样本取微量混合成数个100μL的QC溶液（QC相当于重新制作的样本）。接下来的工作参考文献[12]，取100μL液体加入300μL有机溶剂（甲醇:氯仿=3:1），12000rpm离心10min。取300μL上清液至进样瓶中，加入两种内标（0.3mg/mL氯苯丙胺酸和1mg/mL十七酸）各10μL ，真空旋转干燥至完全干燥。加入80μL的甲氧胺溶液（15mg/m），振荡30s，加入80μL BSTFA(1% TMCS)溶液,70℃下反应60min（DHG-9055A恒温干燥箱），振荡10s。
摘要：代谢组学是对某一生物或细胞在一特定生理时期内所有低分子量代谢产物同时进行定性和定量分析的一门新学科。在代谢组学的研究中，如何高效的提取细胞胞内代谢物是一项重要技术。本实验利用SW480结肠癌细胞株，通过改变、调控细胞淬灭过程中溶液种类和浓度梯度以及抽提过程中抽提溶液成分,并结合GC-TOFMS分析以优化结肠癌细胞胞内代谢物提取方法。结果表明，在淬灭过程中甲醇浓度为50%或者75%且不使用碳酸氢铵缓冲液，而在抽提过程中使用乙腈:甲醇:水为40:40:20的混合液，能更加全面地提取各代谢通路中的重要代谢物。
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关键字:代谢组学；结肠癌细胞；胞内代谢物；提取方法
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摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
1 引言2
2 材料与方法3
2.1 细胞培养 3
2.2 细胞淬灭与抽提3
2.3 细胞样本GC-TOFMS分析前处理工作4
2.4 GC-TOFMS分析4
2.5 GC-TOFMS数据分析4
2.5.1 奇异值校正4
2.5.2 归一化校正4
2.5.3 多元统计分析4
3 结果与讨论4
3.1 结果 4
3.2 讨论 7
4 结论8
致谢8
参考文献9
结肠癌细胞胞内代谢物提取方法的优化研究
引言
1 引言
在蛋白组学和转录组学技术成熟的今天，致力于机体代谢物高通量测量的代谢组学发展相对落后。而基于代谢物水平是所有调控的最终产物的事实，与蛋白组学和转录组学相比，代谢组学能更好地代表细胞表现型[1]。因此，突破代谢组学发展中出现的技术壁垒，优化现有实验条件是十分必要的。
在代谢组学的研究中，如何高效的提取细胞胞内代谢物是一项重要技术，因细胞内酶系活跃、代谢转换迅速, 取样和样品制备方法显著影响分析结果的准确性、重复性。因此, 做好样品的前处理是取得可靠分析结果的先决条件[2]。而传统方法限制了细胞胞内代谢物提取的质量和数量，如胰蛋白酶消化法作为胞内酶淬灭过程中的一种传统方法十分常见，用于消化细胞使其脱离培养基表面，但因改变了细胞外基质而使细胞机能发生改变，从而使细胞代谢物产生了不可逆的转变，因而使胞内代谢物的提取质量劣化。
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提取方法的优化时有报道。09年Christopher A. Sellick[3]等利用中国仓鼠卵巢重组细胞Super-CHO为研究对象，在对比一系列胞内酶淬灭条件后，得出了60%的甲醇和0.85%的碳酸氢铵在-40℃条件下淬灭能产生具有生理代表性的胞内代谢物的结论。同年，Quincy Teng[4]等亦用乳腺癌细胞进行了细胞淬灭条件的优化，用甲醇代替了胰蛋白酶作为胞内酶淬灭剂，并用核磁共振分析证明新方法能比传统方法能更有效地保留50倍左右的细胞胞内代谢物，是一种更快速高效的方法。在此基础上，Anders P.H. Danielsson[5]等在-80℃的温度条件下，用甲醇提取了大鼠胰岛瘤细胞胞内代谢物。08年Jie Yuan[6]等在大肠杆菌代谢动力学通量分析中，于对比7种不同溶剂后，得出乙腈:甲醇:水为40:40:20的混合液的能最大程度地提取胞内代谢物。10年Stefanie Dietmair[7]等以中国仓鼠卵巢重组细胞Super-CHO为研究对象，采用12种不同的方法抽提其胞内代谢物，发现50%的含水乙腈抽提效果最佳。
近年来国内对胞内代谢物的抽提方法的研究也有了较快的发展。11年梅辉[8]等分别使用冷甲醇法、热乙醇法、甲醇/ 氯仿法、热甲醇法和高氯酸法提取大肠杆菌代谢物，发现冷甲醇法所得到的相对提取率最高, 且重复性好。同年，代海洋[9]等培养获取人脐带间充质干细胞，利用高氯酸(perchloric acid,PCA)提取细胞水溶性代谢物，利用甲醇/氯仿(methanol-chloroform, M/C)提取细胞脂溶性代谢物，并使用甲醇/氯仿/水一次性提取方法(dual phase extraction,DPE)同时获取两种组分，发现PCA对水溶性代谢物具有更高的提取效率，M/C对脂溶性代谢物具有更高的提取效率。13年余欣尉[10]等在肺癌细胞代谢组学分析时，使用液氮淬灭和二氯甲烷为溶剂进行抽提。
本研究在前人研究的基础之上，再进一步予以优化，利用SW480结肠癌细胞株，以淬灭过程中的甲醇溶液浓度(浓度梯度分别为50%、75%、100%)和碳酸氢铵溶液浓度(浓度分别为0.85%或不加)，以及抽提过程中的溶液成分(分为50%水相乙腈和乙腈:甲醇:水为40:40:20的混合液)的不同作为变量并经GC-TOFMS分析以优化结肠癌细胞胞内代谢物提取方法，提高胞内代谢物提取的质量与数量，即提取更高浓度更优质的细胞胞内代谢物，以为后续科研工作提供更科学的实验材料和更准确的实验数据。
2 材料与方法
2．1 细胞培养
用含10%胎牛血清的DMEM培养基在含5% CO2?、37 °C的湿润条件下于细胞培养箱内恒温无菌培养SW480结肠癌细胞。
2．2 细胞淬灭与抽提
细胞淬灭与抽提的溶液成分见表1。具体方法如下：用0.9%(w/v) NaCl水溶液轻轻冲洗去细胞培养瓶中的培养基（细胞数量约为5×106个/瓶），清洗中NaCl溶液也要倒掉，清洗过程重复2-3次。向每个培养瓶中加入5mL淬灭液，冰浴5min。用一次性细胞刮刮下细胞，将所有液体倒入15mL离心管中。加入1mL抽提液，冰浴环境下用超声细胞破碎仪破碎细胞（美国SONICS VC255型超声细胞破碎仪，设定程序为“超声2s-停止3s”循环10min）。将剩余溶液分装到多个2mL离心管中（ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥3^5`1^9`1^6^0`7^2$
1.8mL/管），12000rpm离心15min（德国Eppendorf 5415R型冷冻离心机）。取上清液1.5mL至新的2mL离心管中，标记，-80℃保存。
表1. SW480结肠癌细胞胞内代谢物提取方法一览表
Table 1. Extraction method of intracellular metabolites of SW480 colon cancer cells
方法 淬灭过程 抽提过程
甲醇溶液浓度(v/v) 碳酸氢铵溶液浓度(w/v) 抽提液成分
No.1 50% 不加 溶液2
No.2 75% 0.85% 溶液1
No.3 100% 不加 溶液1
No.4 75% 不加 溶液2
No.5 50% 0.85% 溶液1
No.6 100% 0.85% 溶液2
No.7 50% 0.85% 溶液2
No.8 50% 不加 溶液1
No.9 0.9%NaCl (w/v) 溶液1
No.10 0.9%NaCl (w/v) 溶液2
注：溶液1为50%水相乙腈、溶液2为乙腈:甲醇:水为40:40:20的混合液。所有方法的温度条件为4℃。
2．3 细胞样本GC-TOFMS分析前处理工作
取出1.5mL样本，真空旋转干燥至完全干燥，加入150μL超纯水（美国Milli-Q Advantage超纯水系统）。每个样本取微量混合成数个100μL的QC溶液（QC相当于重新制作的样本）。接下来的工作参考文献[12]，取100μL液体加入300μL有机溶剂（甲醇:氯仿=3:1），12000rpm离心10min。取300μL上清液至进样瓶中，加入两种内标（0.3mg/mL氯苯丙胺酸和1mg/mL十七酸）各10μL ，真空旋转干燥至完全干燥。加入80μL的甲氧胺溶液（15mg/m），振荡30s，加入80μL BSTFA(1% TMCS)溶液,70℃下反应60min（DHG-9055A恒温干燥箱），振荡10s。
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