厌氧真菌和甲烷菌共培养在不同碳源下的发酵特性
厌氧真菌和甲烷菌共培养在不同碳源下的发酵特性[20200510204459]
摘要：【目的】本文比较研究了厌氧真菌和甲烷菌天然共培养物分别利用五碳糖和六碳糖的发酵特性，以期更好的了解厌氧真菌在与甲烷菌共生的条件下，对两种不同碳源利用和代谢情况。【方法】本文分别以葡萄糖和木糖为底物，厌氧真菌Piromyces sp. F1和甲烷菌Methanobrevibacter thaueri F1的共培养物为接种物进行96小时发酵，底物为葡萄糖和木糖。利用气压转换仪和气相色谱仪在不同时间点测定产气量、甲烷浓度和发酵液中的乙酸浓度。【结果】葡萄糖组的生长延滞期比木糖组的短，累积产气速度和甲烷生成速度也比木糖组快。相同时间点的总产气量和甲烷产量葡萄糖组显著高于木糖组（P<0.05）。24小时和48小时时葡萄糖组发酵液中乙酸含量显著高于木糖组（P<0.05），而在72小时和96小时时没有显著性差异（P>0.05）。【结论】厌氧真菌和产甲烷菌共培养利用葡萄糖的发酵效率高于木糖。
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关键字:厌氧真菌；甲烷菌；葡萄糖；木糖；代谢
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 培养基成分及其配制 2
1.1.2菌种来源2
1.2 方法 2
1.2.1 发酵试验设计2
1.2.2 甲烷的测定2
1.2.3 总气量的测定2
1.2.4 乙酸的测定3
1.3 主要试剂和仪器 3
1.4 数据处理3
2 结果与分析3
2.1 共培养的发酵结果3
2.1.1 产气量 3
2.1.2 乙酸产量4
3 讨论5
致谢5
参考文献6
厌氧真菌和甲烷菌共培养在不同碳源条件下的发酵特性
引言
引言
瘤胃是一个复杂的生态系统，里面栖居着复杂、多样的微生物，包括瘤胃原虫、瘤胃细菌和厌氧真菌，还有少数噬菌体。经过长期的适应和选择，微生物和宿主之间、微生物与微生物之间处于一种相互依存、相互制约的动态平衡系统中[1]。瘤胃微生物主要功能是帮助消化宿主自身不能消化的植物物质，纤维素、半纤维素等，为宿主提供能量和养分。
自从1975年，Orpin首次证实了厌氧真菌的存在以来，国内外学者已从草食动物的消化道中分离出多种厌氧真菌，目前已发现六个属总计20多个种[2-3]。这些微生物在瘤胃中对草食动物的能量转换起到决定作用。厌氧真菌在反刍动物降解纤维过程中扮演着非常重要的角色，其利用假根系统刺穿植物细胞壁组织，并产生一系列细胞壁降解酶从而将纤维素逐步降解。厌氧真菌能发酵 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
利用的底物范围很广，如纤维素、木聚糖、葡聚糖等植物细胞壁结构性多糖，也有淀粉、糖原等贮存性多糖，还有葡萄糖、果糖、纤维二糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖等单糖及寡糖[4-5]。甲烷是瘤胃中微生物代谢的最终产物，同时也是能量损失的一种体现，因此瘤胃中的甲烷菌被越来越多的学者所研究。
大量研究发现厌氧真菌和产甲烷菌共培养不仅改变了厌氧真菌的代谢途径，对底物的降解和利用也有显著提高。厌氧真菌Neocallimastix frontalis、Neocallimastix patriciarum、Piromyces communis和Caeomyces communis与甲烷菌共培养均可提高对植物细胞壁的降解能力。N. frontalis在12 d内能降53%的滤纸底物，而与反刍兽甲烷短杆菌（Methanobrevibacter ruminantium）共培养7 d就可降解83%的滤纸[6]。N. frontalis发酵5 d可利用59%的木聚糖，与史氏甲烷短杆菌（Methanobrevibacter smithii）共培养则可利用82%的木聚糖。Nakashimada等[7]将厌氧真菌N. frontalis与产甲烷菌Methanobrevibacter formicicum 共培养7d，培养液中没有H2和甲酸积累,与Methanobrevibacter concilii 共培养17d，培养液中乙酸产量降低，将这3株菌共培养17 d，乳酸和乙醇产量降低。
本试验旨在通过研究厌氧真菌和甲烷菌共培养对木糖和葡萄糖的发酵特性，揭示厌氧真菌和甲烷菌共培养五碳糖和六碳糖代谢差异。
1材料和方法
1.1 材料
1.1.1 培养基成分及其配置
本试验所用培养基为完全培养基，参照Barichevich ( 1990 )的方法配制。分别以葡萄糖和木糖作为发酵底物。
1.1.2 菌种来源
试验菌种采用本实验室从本地山羊瘤胃液中分离得到的厌氧真菌和甲烷菌的共培养物(Piromyces sp. F1 + Methanobrevibacter thaueri F1)。实验前将菌种复活后进行滚管纯化3-4次，确保其活性及纯度。
1.2 方法
1.2.1 发酵试验设计
试验分为葡萄糖组 (G) 和木糖组 (X) 。每个组设6个重复并设空白对照。接种前半天前先将维生素和青链霉素加入培养基，然后将培养基置于39℃培养箱预热；接种结束后，用气压转换仪 ( IGER，UK ) 平衡发酵瓶内气压，使初始气压与大气压平衡，39℃静置培养。分别于不同时间点测定产气量和甲烷产量。并在相应采样点测定pH值，并取上清液于-20℃保存，以备测相应指标。
1.2.2 甲烷的测定
甲烷的测定采用气相色谱法。所用仪器为：GC-7890B型气相色谱仪（美国安捷伦）。于8 h、16h、24 h、32 h、40 h、48 h、56 h、64 h、72 h、80h和96 h测定发酵瓶内甲烷产量。测定甲烷产气量时，要对进样针和操作桌面用75%的酒精消毒，并对每组发酵瓶瓶盖也进行消毒。将各时间点的甲烷产量相加得到累计甲烷产量。
1.2.3 总产气量的测定
总产物量的测定参照 Theodorou 等[8]的方法，于8 h *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
、16h、24 h、32 h、40 h、48 h、56 h、64 h、72 h、80h和96 h测定发酵瓶内产气量。注意全程无菌操作，对气压转换器的针头和操作桌面用75%的酒精消毒，并对每组发酵瓶瓶盖用75%的酒精消毒。将各时间点的产气量相加得到累计产气量。
1.2.4 乙酸的测定
利用毛细管气相色谱检测。样品测定前，取1 mL的发酵液到离心管中，再加入0.2 mL的25 %（w/v）偏磷酸巴豆酸混合溶液，巴豆酸作内标，-20 ℃保存，用前12000 rpm离心10 min，重复两次，取上清。色谱条件：色谱柱采用毛细吸管柱，柱温115 ℃，汽化温度200℃，采用氢离子火焰检测器，检测温度200 ℃，载气为氮气。
1.3 主要试剂和仪器
GC-7890B型气相色谱仪(美国安捷伦)，气压转换器( IGER，UK )，厌氧滚管，隔水式恒温培养箱，厌氧分装系统，青链霉素粉剂。
1.4 数据处理
数据经Excel 2007 初步处理后，利用SPSS(16.0)进行统计分析，采用独立样本t检验进行均值比较，置信区间为95%。数据以6个重复的平均值±标准误的形式表示。
2 结果与分析
2.1 共培养的发酵结果
2.1.1 产气量
如图1所示，两条曲线分别是厌氧真菌和甲烷菌共培养以葡萄糖和木糖为底物发酵的累计产气量。两条累计产气量曲线均呈现“S”型生长曲线。以葡萄糖为底物时，共培养物更早的进入快速生长期，在56小时累计产气量不在增长进入稳定阶段。以木糖为底物发酵时，在96小时累积产气量还有增长的趋势，但已经接近平稳期。对比两条累积产气量曲线，发现每个时间点的总产气量葡萄糖组均高于木糖组。
图1累积产气量曲线图
如图2所示，两条曲线分别是厌氧真菌和甲烷菌共培养以葡萄糖和木糖为底物发酵的甲烷产量。与累积产气量相同也呈现为“S”型生长曲线。葡萄糖组在56小时时，甲烷生成进入稳定阶段，而木糖组在96小时才进入稳定阶段。木糖组的甲烷产量随着时间推移慢慢的接近葡萄糖组的甲烷产量，最终在96小时时两曲线相交。
摘要：【目的】本文比较研究了厌氧真菌和甲烷菌天然共培养物分别利用五碳糖和六碳糖的发酵特性，以期更好的了解厌氧真菌在与甲烷菌共生的条件下，对两种不同碳源利用和代谢情况。【方法】本文分别以葡萄糖和木糖为底物，厌氧真菌Piromyces sp. F1和甲烷菌Methanobrevibacter thaueri F1的共培养物为接种物进行96小时发酵，底物为葡萄糖和木糖。利用气压转换仪和气相色谱仪在不同时间点测定产气量、甲烷浓度和发酵液中的乙酸浓度。【结果】葡萄糖组的生长延滞期比木糖组的短，累积产气速度和甲烷生成速度也比木糖组快。相同时间点的总产气量和甲烷产量葡萄糖组显著高于木糖组（P<0.05）。24小时和48小时时葡萄糖组发酵液中乙酸含量显著高于木糖组（P<0.05），而在72小时和96小时时没有显著性差异（P>0.05）。【结论】厌氧真菌和产甲烷菌共培养利用葡萄糖的发酵效率高于木糖。
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关键字:厌氧真菌；甲烷菌；葡萄糖；木糖；代谢
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Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 培养基成分及其配制 2
1.1.2菌种来源2
1.2 方法 2
1.2.1 发酵试验设计2
1.2.2 甲烷的测定2
1.2.3 总气量的测定2
1.2.4 乙酸的测定3
1.3 主要试剂和仪器 3
1.4 数据处理3
2 结果与分析3
2.1 共培养的发酵结果3
2.1.1 产气量 3
2.1.2 乙酸产量4
3 讨论5
致谢5
参考文献6
厌氧真菌和甲烷菌共培养在不同碳源条件下的发酵特性
引言
引言
瘤胃是一个复杂的生态系统，里面栖居着复杂、多样的微生物，包括瘤胃原虫、瘤胃细菌和厌氧真菌，还有少数噬菌体。经过长期的适应和选择，微生物和宿主之间、微生物与微生物之间处于一种相互依存、相互制约的动态平衡系统中[1]。瘤胃微生物主要功能是帮助消化宿主自身不能消化的植物物质，纤维素、半纤维素等，为宿主提供能量和养分。
自从1975年，Orpin首次证实了厌氧真菌的存在以来，国内外学者已从草食动物的消化道中分离出多种厌氧真菌，目前已发现六个属总计20多个种[2-3]。这些微生物在瘤胃中对草食动物的能量转换起到决定作用。厌氧真菌在反刍动物降解纤维过程中扮演着非常重要的角色，其利用假根系统刺穿植物细胞壁组织，并产生一系列细胞壁降解酶从而将纤维素逐步降解。厌氧真菌能发酵 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
利用的底物范围很广，如纤维素、木聚糖、葡聚糖等植物细胞壁结构性多糖，也有淀粉、糖原等贮存性多糖，还有葡萄糖、果糖、纤维二糖、乳糖、麦芽糖和蔗糖等单糖及寡糖[4-5]。甲烷是瘤胃中微生物代谢的最终产物，同时也是能量损失的一种体现，因此瘤胃中的甲烷菌被越来越多的学者所研究。
大量研究发现厌氧真菌和产甲烷菌共培养不仅改变了厌氧真菌的代谢途径，对底物的降解和利用也有显著提高。厌氧真菌Neocallimastix frontalis、Neocallimastix patriciarum、Piromyces communis和Caeomyces communis与甲烷菌共培养均可提高对植物细胞壁的降解能力。N. frontalis在12 d内能降53%的滤纸底物，而与反刍兽甲烷短杆菌（Methanobrevibacter ruminantium）共培养7 d就可降解83%的滤纸[6]。N. frontalis发酵5 d可利用59%的木聚糖，与史氏甲烷短杆菌（Methanobrevibacter smithii）共培养则可利用82%的木聚糖。Nakashimada等[7]将厌氧真菌N. frontalis与产甲烷菌Methanobrevibacter formicicum 共培养7d，培养液中没有H2和甲酸积累,与Methanobrevibacter concilii 共培养17d，培养液中乙酸产量降低，将这3株菌共培养17 d，乳酸和乙醇产量降低。
本试验旨在通过研究厌氧真菌和甲烷菌共培养对木糖和葡萄糖的发酵特性，揭示厌氧真菌和甲烷菌共培养五碳糖和六碳糖代谢差异。
1材料和方法
1.1 材料
1.1.1 培养基成分及其配置
本试验所用培养基为完全培养基，参照Barichevich ( 1990 )的方法配制。分别以葡萄糖和木糖作为发酵底物。
1.1.2 菌种来源
试验菌种采用本实验室从本地山羊瘤胃液中分离得到的厌氧真菌和甲烷菌的共培养物(Piromyces sp. F1 + Methanobrevibacter thaueri F1)。实验前将菌种复活后进行滚管纯化3-4次，确保其活性及纯度。
1.2 方法
1.2.1 发酵试验设计
试验分为葡萄糖组 (G) 和木糖组 (X) 。每个组设6个重复并设空白对照。接种前半天前先将维生素和青链霉素加入培养基，然后将培养基置于39℃培养箱预热；接种结束后，用气压转换仪 ( IGER，UK ) 平衡发酵瓶内气压，使初始气压与大气压平衡，39℃静置培养。分别于不同时间点测定产气量和甲烷产量。并在相应采样点测定pH值，并取上清液于-20℃保存，以备测相应指标。
1.2.2 甲烷的测定
甲烷的测定采用气相色谱法。所用仪器为：GC-7890B型气相色谱仪（美国安捷伦）。于8 h、16h、24 h、32 h、40 h、48 h、56 h、64 h、72 h、80h和96 h测定发酵瓶内甲烷产量。测定甲烷产气量时，要对进样针和操作桌面用75%的酒精消毒，并对每组发酵瓶瓶盖也进行消毒。将各时间点的甲烷产量相加得到累计甲烷产量。
1.2.3 总产气量的测定
总产物量的测定参照 Theodorou 等[8]的方法，于8 h *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
、16h、24 h、32 h、40 h、48 h、56 h、64 h、72 h、80h和96 h测定发酵瓶内产气量。注意全程无菌操作，对气压转换器的针头和操作桌面用75%的酒精消毒，并对每组发酵瓶瓶盖用75%的酒精消毒。将各时间点的产气量相加得到累计产气量。
1.2.4 乙酸的测定
利用毛细管气相色谱检测。样品测定前，取1 mL的发酵液到离心管中，再加入0.2 mL的25 %（w/v）偏磷酸巴豆酸混合溶液，巴豆酸作内标，-20 ℃保存，用前12000 rpm离心10 min，重复两次，取上清。色谱条件：色谱柱采用毛细吸管柱，柱温115 ℃，汽化温度200℃，采用氢离子火焰检测器，检测温度200 ℃，载气为氮气。
1.3 主要试剂和仪器
GC-7890B型气相色谱仪(美国安捷伦)，气压转换器( IGER，UK )，厌氧滚管，隔水式恒温培养箱，厌氧分装系统，青链霉素粉剂。
1.4 数据处理
数据经Excel 2007 初步处理后，利用SPSS(16.0)进行统计分析，采用独立样本t检验进行均值比较，置信区间为95%。数据以6个重复的平均值±标准误的形式表示。
2 结果与分析
2.1 共培养的发酵结果
2.1.1 产气量
如图1所示，两条曲线分别是厌氧真菌和甲烷菌共培养以葡萄糖和木糖为底物发酵的累计产气量。两条累计产气量曲线均呈现“S”型生长曲线。以葡萄糖为底物时，共培养物更早的进入快速生长期，在56小时累计产气量不在增长进入稳定阶段。以木糖为底物发酵时，在96小时累积产气量还有增长的趋势，但已经接近平稳期。对比两条累积产气量曲线，发现每个时间点的总产气量葡萄糖组均高于木糖组。
图1累积产气量曲线图
如图2所示，两条曲线分别是厌氧真菌和甲烷菌共培养以葡萄糖和木糖为底物发酵的甲烷产量。与累积产气量相同也呈现为“S”型生长曲线。葡萄糖组在56小时时，甲烷生成进入稳定阶段，而木糖组在96小时才进入稳定阶段。木糖组的甲烷产量随着时间推移慢慢的接近葡萄糖组的甲烷产量，最终在96小时时两曲线相交。
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