猪流行性腹泻病毒s蛋白的原核表达
猪流行性腹泻病是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的高度接触性肠道传染病；各年龄段的猪均可感染，且主要危害仔猪，对仔猪致死率极高,对养猪业危害极大；临床症状主要为呕吐、水样腹泻以及脱水。PEDV S蛋白在刺激机体产生中和抗体以及诱导产生黏膜免疫的过程中起重要作用；且通过与Gene Bank中的其它PEDV毒株比较发现S基因有较强的保守性，因而可作为理想的抗原来检测PEDV。本实验采用基因工程方法，将S基因密码子优化为大肠杆菌偏噬性密码子，再通过原核表达条件优化方法，诱导S蛋白表达，并将其大量纯化。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words 2
引言2
1 材料与方法3
1.1 实验材料3
1.1.1 质粒和表达载体3
1.1.2 菌株3
1.1.3 主要试剂和材料3
1.1.4 主要仪器设备4
1.2 实验方法 5
1.2.1 表达载体pET28aS1，pET28aS2建立 5
1.2.2 目的蛋白的诱导表达5
1.2.3 SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS一PAGE)分析5
1.2.4 WesternBlot 分析 6
1.2.5 纯化重组蛋白的制备7
2 结果与分析7
2.1 重组蛋白的诱导表达与鉴定7
2.2 重组蛋白可溶性检测9
2.3 重组蛋白的纯化结果 10
3 讨论 11
3.1 感受态的制备 11
3.2蛋白诱导条件的筛选11
3.3目的蛋白的纯化11
致谢 13
参考文献 13
猪流行性腹泻病毒S蛋白的原核表达
引言
引言
猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的高度接触性肠道传染病[1]，临床症状以呕吐、水样腹泻、脱水为主[2]。各年龄段及各品种的猪均易感PEDV，仔猪尤其易感，且致死率极高，一周龄以内的仔猪死亡率可达90%以上，是一种严重危害养猪业的传染性疾病[3]。 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
自1971年英国首次报道本病[4]，比利时、德国、加拿大等国相继报道本病的出现，1976年我国首次报道了该病[5]。PED与猪传染性胃肠炎在临床症状、病理剖检、流行病学特征等方面较为相似，因而不易作出快速诊断[5]。目前诊断PED的常用手段依然是实验室诊断法，包括ELISA、免疫荧光定量法、RTPCR等方法[7]。除RTPCR方法外，其他实验室诊断方法多以全病毒制成诊断试剂，因而存在病毒排散的潜在风险，不适用于生产实践[8]。PEDV S蛋白（纤突蛋白）在刺激机体产生中和抗体与诱导机体产生黏膜免疫的过程中起重要作用；且通过与Gene Bank中的其它毒株比较发现S蛋白基因有较强的保守性，因而可作为理想的抗原来检测PEDV[9]。本实验以探索如何获得S基因在体外的有效蛋白产物为目的，通过采用基因工程方法，将S基因密码子优化为大肠杆菌偏噬性密码子，再通过原核表达条件优化方法，诱导表达S蛋白，并将其大量纯化。这对于初步建立ELISA方法以及研制新型诊断试剂具有重要意义。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1.1.1质粒和表达载体
根据本实验室分离的PEDV SH变异毒株S基因序列分割成PEDVS1和PEDVS2片段，由南京金斯瑞生物公司优化合成，亚克隆到pET28a载体上，并在两端插入BamHI和XhoI酶切位点；pET28a质粒由本实验室保存。
1.1.2 菌株
E.coli Rosetta菌（DE3）来自本实验室。
1.1.3 主要试剂与材料
(1)蛋白marker购自Takara公司。
(2)βD半乳糖苷（IPTG）购自Takara公司。
(3)kan购自Takara公司。
(4)ECL化学发光试剂盒购自购自Tanon公司。
(5)HisTag单克隆抗体购自Abcam公司。
(6)辣根过氧化氢物酶标记山羊抗小鼠IgG购至碧云天生物公司。
(7)液体LB培养基(1L)
成分
量（单位：g）
NaCl
10
TRYPTONE
10
YEAST EXTRACT
5
表11
(8)1X PBS(1L)
成分
浓度(mmol/L)
量（单位：g）
NaCl
137
8
KCl
2.7
0.2
Na2HPO4
10
1.44
KH2PO4
2
0.24
加入800mL的ddH2O,用HCl调节PH至7.4，补水至1L，高压灭菌。
表12
(9)30%聚丙烯酰胺（100mL,配时戴手套和口罩）
成分
量（单位：g）
丙烯酰胺
29.0
亚甲基双丙烯酰胺
1.0
加蒸馏水定容至100mL,于37℃助溶过夜，使用0.45μm滤膜过滤杂质后保存于4℃。
表13
(10)APS（10%过硫酸铵，1mL）
成分
量
过硫酸铵
0.1g
蒸馏水
1mL
表14
(11)1.5M TrisHCl(pH8.8,100mL)
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words 2
引言2
1 材料与方法3
1.1 实验材料3
1.1.1 质粒和表达载体3
1.1.2 菌株3
1.1.3 主要试剂和材料3
1.1.4 主要仪器设备4
1.2 实验方法 5
1.2.1 表达载体pET28aS1，pET28aS2建立 5
1.2.2 目的蛋白的诱导表达5
1.2.3 SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS一PAGE)分析5
1.2.4 WesternBlot 分析 6
1.2.5 纯化重组蛋白的制备7
2 结果与分析7
2.1 重组蛋白的诱导表达与鉴定7
2.2 重组蛋白可溶性检测9
2.3 重组蛋白的纯化结果 10
3 讨论 11
3.1 感受态的制备 11
3.2蛋白诱导条件的筛选11
3.3目的蛋白的纯化11
致谢 13
参考文献 13
猪流行性腹泻病毒S蛋白的原核表达
引言
引言
猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的高度接触性肠道传染病[1]，临床症状以呕吐、水样腹泻、脱水为主[2]。各年龄段及各品种的猪均易感PEDV，仔猪尤其易感，且致死率极高，一周龄以内的仔猪死亡率可达90%以上，是一种严重危害养猪业的传染性疾病[3]。 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
自1971年英国首次报道本病[4]，比利时、德国、加拿大等国相继报道本病的出现，1976年我国首次报道了该病[5]。PED与猪传染性胃肠炎在临床症状、病理剖检、流行病学特征等方面较为相似，因而不易作出快速诊断[5]。目前诊断PED的常用手段依然是实验室诊断法，包括ELISA、免疫荧光定量法、RTPCR等方法[7]。除RTPCR方法外，其他实验室诊断方法多以全病毒制成诊断试剂，因而存在病毒排散的潜在风险，不适用于生产实践[8]。PEDV S蛋白（纤突蛋白）在刺激机体产生中和抗体与诱导机体产生黏膜免疫的过程中起重要作用；且通过与Gene Bank中的其它毒株比较发现S蛋白基因有较强的保守性，因而可作为理想的抗原来检测PEDV[9]。本实验以探索如何获得S基因在体外的有效蛋白产物为目的，通过采用基因工程方法，将S基因密码子优化为大肠杆菌偏噬性密码子，再通过原核表达条件优化方法，诱导表达S蛋白，并将其大量纯化。这对于初步建立ELISA方法以及研制新型诊断试剂具有重要意义。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1.1.1质粒和表达载体
根据本实验室分离的PEDV SH变异毒株S基因序列分割成PEDVS1和PEDVS2片段，由南京金斯瑞生物公司优化合成，亚克隆到pET28a载体上，并在两端插入BamHI和XhoI酶切位点；pET28a质粒由本实验室保存。
1.1.2 菌株
E.coli Rosetta菌（DE3）来自本实验室。
1.1.3 主要试剂与材料
(1)蛋白marker购自Takara公司。
(2)βD半乳糖苷（IPTG）购自Takara公司。
(3)kan购自Takara公司。
(4)ECL化学发光试剂盒购自购自Tanon公司。
(5)HisTag单克隆抗体购自Abcam公司。
(6)辣根过氧化氢物酶标记山羊抗小鼠IgG购至碧云天生物公司。
(7)液体LB培养基(1L)
成分
量（单位：g）
NaCl
10
TRYPTONE
10
YEAST EXTRACT
5
表11
(8)1X PBS(1L)
成分
浓度(mmol/L)
量（单位：g）
NaCl
137
8
KCl
2.7
0.2
Na2HPO4
10
1.44
KH2PO4
2
0.24
加入800mL的ddH2O,用HCl调节PH至7.4，补水至1L，高压灭菌。
表12
(9)30%聚丙烯酰胺（100mL,配时戴手套和口罩）
成分
量（单位：g）
丙烯酰胺
29.0
亚甲基双丙烯酰胺
1.0
加蒸馏水定容至100mL,于37℃助溶过夜，使用0.45μm滤膜过滤杂质后保存于4℃。
表13
(10)APS（10%过硫酸铵，1mL）
成分
量
过硫酸铵
0.1g
蒸馏水
1mL
表14
(11)1.5M TrisHCl(pH8.8,100mL)
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