和缓艾美耳球虫肌动蛋白解聚因子基因的克隆与原核表达
为研究和缓艾美耳球虫肌动蛋白解聚因子（ADF）的免疫原性，对和缓艾美耳球虫(E.mitis)的ADF基因进行了克隆和原核表达。根据GenBank上已公布的ADF基因序列设计1对特异性引物，采用RT-PCR技术扩增和缓艾美耳球虫的ADF基因，并与原核表达载体pET-32a连接，构建原核表达载体pET-32a-ADF，转化入大肠杆菌BL21中，IPTG诱导表达，经SDS-PAGE 鉴定表达产物。结果表明，试验成功克隆了和缓艾美耳球虫的ADF基因，并表达出了分子质量单位约为30 KD的融合蛋白，蛋白在上清和包涵体中均有存在，主要存在于上清中。该试验为ADF的免疫原性研究奠定了基础，并为和缓艾美耳球虫病的免疫防治的候选疫苗基因的筛选奠定了基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．1. 1 虫种、菌种、载体 2
1. 1. 2 主要试剂 2
1. 2 方法 3
1．2. 1 ADF基因的引物设计与合成 3
1. 2. 2 和缓艾美耳球虫卵囊总RNA的提取 3
1. 2. 3 RTPCR扩增 4
1. 2. 4 PCR产物的克隆与序列分析 4
1.2.4.1 PCR产物的回收 4
1.2.4.2 重组质粒的构建 4
1.2.4.3 连接产物的转化 5
1.2.4.4 重组质粒的提取与序列测定及分析 5
1. 2. 5 重组质粒的原核表达 5
1.2.5.1 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 5
1.2.5.2 原核表达产物的纯化 5
1.2.5.3 重组表达蛋白分析 5
2 结果与分析 5
2．1 ADF基因的克隆 5
2. 2 ADF基因的重组表达质粒鉴定 6
2. 3 和缓艾美耳球虫ADF基因的序列分析 6
2. 4 ADF基因在大肠杆菌中的表达 8
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
2.4.1 表达产物的SDSPAGE及可溶性分析 8
2.4.2 重组蛋白ADF的纯化 9
3 讨论 9
致谢 10
参考文献： 10
和缓艾美耳球虫肌动蛋白解聚因子基因的克隆与原核表达
引言
鸡球虫病是造成全世界养禽业经济损失最重要的寄生虫病，其中以艾美耳属球虫感染引起的病变最严重。其中，和缓艾美耳球虫（E.mitis）是一种致病力相对较弱的艾美耳球虫。早年的研究也认为E.mitis和E.praecox 是温和的没有什么危害的球虫。因而E.mitis没有引起人们足够的关注, 有关防治E.mitis感染的报道很少，且多数都囊括在防治各种危害严重的球虫感染方案之内[1]。随着对鸡球虫病的研究深入，证明和缓艾美耳球虫虽然致病力较其他虫种较弱，但对鸡增重和饲料转化率影响明显，影响养鸡业的经济效益，应该引起重视[2]。目前，控制鸡球虫感染仍以抗球虫药物为主，这些治疗方式有很多缺点，由于抗球虫药使用的太久，鸡球虫产生耐药性、药物残留已成为现在面临的主要问题，过去使用的抗球虫药现在很多都没有用，近年很多研究表明通过接种抗球虫病重组抗原[35]或DNA疫苗[68]会刺激机体的体液和细胞免疫反应[9]，若用细胞因子作为传送佐剂可以提高 DNA疫苗或重组抗原诱导广泛的和持久的体液和细胞免疫的潜力[1012]。免疫预防乃是迄今解决耐药性和药物残留问题的有效途径。随着分子生物学和免疫学的快速发展，人们迫切希望通过基因工程手段来研制新型基因工程疫苗, 为鸡球虫病的防治提供新的方向。
本实验室通过Western blot、双向电泳、MALDITOFTOF串联质谱鉴定相结合的方法筛选到了肌动蛋白解聚因子（ADF）等可能具有免疫原性的蛋白。肌动蛋白解聚因子（actin depolymerizing factor，ADF）蛋白是一种具有较好的抗原性的表面抗原。经过各种研究表明，顶复门原虫含有顶复门器，ADF蛋白使顶复门原虫具有保守的入侵宿主细胞机制[13]，ADF和其他新的基因都有可能成为重组疫苗的侯选基因。本研究拟克隆和缓艾美耳球虫的ADF基因并原核表达ADF蛋白，为其免疫原性研究奠定基础,从而为其在和缓艾美耳球虫病的免疫防治候选疫苗分子的筛选奠定基础。
材料与方法
1．1 材料
1. 1. 1 虫种、菌种、载体 和缓艾美耳球虫孢子化卵囊、表达宿主菌BL21、表达载体质粒pET32a(+)均由大学兽医寄生虫病学实验室保存。
1. 1. 2 主要试剂 DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker 、LA Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ均为宝生物工程（大连）有限公司产品。DEPC试剂为Invitrogen 公司产品。DNA凝胶回收试剂盒为美国Axygen产品。
LB液体培养基、LB固体培养基、TBE缓冲液配置、SDSPAGE电泳缓冲液、SDSPAGE电泳loading buffer、聚丙烯酰胺蛋白质凝胶、考马斯亮蓝染色液、考马斯亮蓝染色脱色液配置如下：
(1) LB液体培养基(1 L)：
Tryptone 1 %
NaCl 1 %
Yeast Extract 0.5 %
配制时，在1 L容器中加入10 g Tryptone、5 g Yeast Extract、10 g NaCl，加入大概300 mL的去离子水，搅拌溶解，然后定容至1 L。分装至试管，高压灭菌，115 ℃ ，20 min。
(2) LB固体培养基(1 L)：
Tryptone 1 %
NaCl 1 %
Yeast Extract 0.5 %
Agar 1.5 %
配制时，在1 L容器中加入10 g Tryptone、5 g Yeast Extract、10 g NaCl，加入大概300 mL的去离子水，用玻璃棒搅拌使其溶解，然后用去离子水定容至1 L，然后加入15 g琼脂。高压灭菌，115 ℃ ，20 min。灭菌完后倒入平板。
（3）5×TBE缓冲液配置（1 L）
配置时，在1 L容器中加入54 g Tris碱，27.5 g硼酸，3.72 g Na2EDTAH2O，加入大概300 mL的去离子水，用玻璃棒搅拌使其溶解，然后用去离子水定容至1 L。高压灭菌，115 ℃ ，20 min。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1．1 材料 2
1．1. 1 虫种、菌种、载体 2
1. 1. 2 主要试剂 2
1. 2 方法 3
1．2. 1 ADF基因的引物设计与合成 3
1. 2. 2 和缓艾美耳球虫卵囊总RNA的提取 3
1. 2. 3 RTPCR扩增 4
1. 2. 4 PCR产物的克隆与序列分析 4
1.2.4.1 PCR产物的回收 4
1.2.4.2 重组质粒的构建 4
1.2.4.3 连接产物的转化 5
1.2.4.4 重组质粒的提取与序列测定及分析 5
1. 2. 5 重组质粒的原核表达 5
1.2.5.1 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 5
1.2.5.2 原核表达产物的纯化 5
1.2.5.3 重组表达蛋白分析 5
2 结果与分析 5
2．1 ADF基因的克隆 5
2. 2 ADF基因的重组表达质粒鉴定 6
2. 3 和缓艾美耳球虫ADF基因的序列分析 6
2. 4 ADF基因在大肠杆菌中的表达 8
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
2.4.1 表达产物的SDSPAGE及可溶性分析 8
2.4.2 重组蛋白ADF的纯化 9
3 讨论 9
致谢 10
参考文献： 10
和缓艾美耳球虫肌动蛋白解聚因子基因的克隆与原核表达
引言
鸡球虫病是造成全世界养禽业经济损失最重要的寄生虫病，其中以艾美耳属球虫感染引起的病变最严重。其中，和缓艾美耳球虫（E.mitis）是一种致病力相对较弱的艾美耳球虫。早年的研究也认为E.mitis和E.praecox 是温和的没有什么危害的球虫。因而E.mitis没有引起人们足够的关注, 有关防治E.mitis感染的报道很少，且多数都囊括在防治各种危害严重的球虫感染方案之内[1]。随着对鸡球虫病的研究深入，证明和缓艾美耳球虫虽然致病力较其他虫种较弱，但对鸡增重和饲料转化率影响明显，影响养鸡业的经济效益，应该引起重视[2]。目前，控制鸡球虫感染仍以抗球虫药物为主，这些治疗方式有很多缺点，由于抗球虫药使用的太久，鸡球虫产生耐药性、药物残留已成为现在面临的主要问题，过去使用的抗球虫药现在很多都没有用，近年很多研究表明通过接种抗球虫病重组抗原[35]或DNA疫苗[68]会刺激机体的体液和细胞免疫反应[9]，若用细胞因子作为传送佐剂可以提高 DNA疫苗或重组抗原诱导广泛的和持久的体液和细胞免疫的潜力[1012]。免疫预防乃是迄今解决耐药性和药物残留问题的有效途径。随着分子生物学和免疫学的快速发展，人们迫切希望通过基因工程手段来研制新型基因工程疫苗, 为鸡球虫病的防治提供新的方向。
本实验室通过Western blot、双向电泳、MALDITOFTOF串联质谱鉴定相结合的方法筛选到了肌动蛋白解聚因子（ADF）等可能具有免疫原性的蛋白。肌动蛋白解聚因子（actin depolymerizing factor，ADF）蛋白是一种具有较好的抗原性的表面抗原。经过各种研究表明，顶复门原虫含有顶复门器，ADF蛋白使顶复门原虫具有保守的入侵宿主细胞机制[13]，ADF和其他新的基因都有可能成为重组疫苗的侯选基因。本研究拟克隆和缓艾美耳球虫的ADF基因并原核表达ADF蛋白，为其免疫原性研究奠定基础,从而为其在和缓艾美耳球虫病的免疫防治候选疫苗分子的筛选奠定基础。
材料与方法
1．1 材料
1. 1. 1 虫种、菌种、载体 和缓艾美耳球虫孢子化卵囊、表达宿主菌BL21、表达载体质粒pET32a(+)均由大学兽医寄生虫病学实验室保存。
1. 1. 2 主要试剂 DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker 、LA Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ均为宝生物工程（大连）有限公司产品。DEPC试剂为Invitrogen 公司产品。DNA凝胶回收试剂盒为美国Axygen产品。
LB液体培养基、LB固体培养基、TBE缓冲液配置、SDSPAGE电泳缓冲液、SDSPAGE电泳loading buffer、聚丙烯酰胺蛋白质凝胶、考马斯亮蓝染色液、考马斯亮蓝染色脱色液配置如下：
(1) LB液体培养基(1 L)：
Tryptone 1 %
NaCl 1 %
Yeast Extract 0.5 %
配制时，在1 L容器中加入10 g Tryptone、5 g Yeast Extract、10 g NaCl，加入大概300 mL的去离子水，搅拌溶解，然后定容至1 L。分装至试管，高压灭菌，115 ℃ ，20 min。
(2) LB固体培养基(1 L)：
Tryptone 1 %
NaCl 1 %
Yeast Extract 0.5 %
Agar 1.5 %
配制时，在1 L容器中加入10 g Tryptone、5 g Yeast Extract、10 g NaCl，加入大概300 mL的去离子水，用玻璃棒搅拌使其溶解，然后用去离子水定容至1 L，然后加入15 g琼脂。高压灭菌，115 ℃ ，20 min。灭菌完后倒入平板。
（3）5×TBE缓冲液配置（1 L）
配置时，在1 L容器中加入54 g Tris碱，27.5 g硼酸，3.72 g Na2EDTAH2O，加入大概300 mL的去离子水，用玻璃棒搅拌使其溶解，然后用去离子水定容至1 L。高压灭菌，115 ℃ ，20 min。
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