市某猪场猪四种病毒性疫病混合感染的鉴定
：重庆市某猪场出现了一起以母猪发生繁殖障碍，新生仔发病率和病死率均高为特征的疾病。经过流行病学调查、临床症状观察、病理学检查与实验室检测，诊断为猪圆环病毒II型、细小病毒、伪狂犬病毒、日本乙型脑炎病毒混合感染。采用隔离消毒和用药治疗等综合性措施后，疫情已得到有效的控制，猪场进入正常生产。本次病例的诊治为养猪业可能发生的猪圆环病毒II型、细小病毒、伪狂犬病毒、日本乙型脑炎病毒混合感染提供了可行性建议和借鉴经验。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1□材料与方法2
1.1□材料 2
1.1.1□病料来源2
1.1.2□主要试剂2
1.1.3□主要仪器2
1.2□方法 2
1.2.1□发病情况2
1.2.2□病理剖检2
1.2.3□细菌学检测3
1.2.4□血清学检测3
1.2.5□分子生物学检测3
2□结果与分析5
2.1□病理变化5
2.2□细菌学检查5
2.3□血清学检测结果6
2.4□分子生物学检测结果6
2.5□治疗与转归7
2.5.1□隔离消毒7
2.5.2□治疗用药7
2.5.3□转归情况7
3□讨论8
3.1□心得体会8
3.2□预防措施8
3.2.1□免疫接种8
3.2.2□疾病净化8
3.2.3□消毒杀虫8
3.2.4□管理方式9
3.2.5□营养水平9
致谢9
参考文献9
重庆市某猪场猪四种病毒性疫病混合感染的鉴定
引言
混合感染由两种或两种以上的病原微生物同时参与[1]。通常引起混合感染的病原体类型为病毒、细菌、支原体和寄生虫等，各种病原体构成的组合多种多样，其中较为流行的疾病有猪呼吸道疾病综合征、猪高热综合征等[24]。多种病原体混合感染往往造成高的发病率和死亡率
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，并且症状复杂而不典型，给兽医工作者的诊断和防治带来了巨大挑战。
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2， PCV2) 具有免疫抑制性，能够诱发多种病原体混合感染，可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪呼吸道疾病综合征、猪皮炎和肾病综合征等多种疾病[5，6]；猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)能引起初产母猪繁殖障碍，主要特征是导致母猪受孕失败，延迟发情，发生流产、死胎、胎儿木乃伊化及新生仔猪的死亡[7，8]；猪感染伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)的症状因日龄而异，仔猪常表现神经症状，育肥猪和成年猪常表现呼吸症状，母猪则表现为返情，屡配不孕，妊娠母猪流产，产出死胎或木乃伊胎，而公猪通常发生睾丸肿胀或者睾丸萎缩 [911]；日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)是一种重要的人畜共患病病原，可使怀孕母猪流产、产木乃伊胎或畸形胎，公猪出现睾丸炎，丧失繁殖能力，仔猪出现神经症状甚至在几日内死亡[12]。目前较少有关于PCV2、PPV、PRV、JEV混合感染的报道，本文通过对一起猪繁殖障碍性疾病进行诊断与治疗，可为进一步研究PCV2、PPV、PRV、JEV混合感染的防治方法提供可行性建议和借鉴经验。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 病料来源
重庆市某猪场患病猪群中选出20只进行临床诊断和实验室诊断。
1．1．2 主要试剂
作为阳性对照的猪圆环病毒II型、细小病毒、伪狂犬病毒、日本乙型脑炎病毒由重庆市动物疫病预防控制中心保存，革兰氏染液由重庆市动物疫病预防控制中心提供，猪圆环病毒II型、细小病毒、伪狂犬病毒、日本乙型脑炎病毒的抗体检测试剂盒均购自武汉科前动物生物制品有限责任公司，DNA抽提试剂盒和RNA抽提试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司，PCR试剂盒、RTPCR试剂盒以及DNA Marker 购自TaKaRa公司，其他试剂均为进口或国产分析纯。
1．1．3 主要仪器
光学显微镜、分光光度计、离心机、涡旋混匀器、电热水浴锅、PCR仪、核酸胶电泳槽、凝胶图像分析仪等。
1．2 方法
1．2．1 发病情况
重庆市某猪场现存栏700余头，已预防接种过猪瘟、猪丹毒、猪肺疫以及猪繁殖与呼吸综合征疫苗。自2015年4月，该猪场陆续发现30余头母猪发生繁殖障碍，发病母猪流产或产下死胎、弱胎和少数木乃伊胎，经产母猪与初产母猪的发病率相差不大。存活的新生仔猪精神不振，食欲减退，体温41～42℃，常突然发病，呕吐，腹泻，口角流出泡沫样唾液，发抖甚至痉挛，行走不稳，运动不协调，呈后退、转圈运动，发病率和死亡率都很高。曾使用过青霉素、链霉素及磺胺类药物，均无明显疗效。
1．2．2 病理剖检
选择三头症状典型的病猪进行剖检，具体方法为：先进行外部检查，如可视粘膜颜色、皮肤有无异常、淋巴结是否肿胀等；之后取背卧位固定尸体，剖开腹腔，检查胃、肠、肝、胆、脾、肾、膀胱等脏器；再剖开胸腔，检查心、肺；最后剖开颅腔，摘出大脑进行检查，并记录结果。
1．2．3 细菌学检测
采集病猪组织脏器，按常规方法进行涂片，采用革兰氏染色法进行染色，之后镜检，具体步骤如下:在一片干净的载玻片上滴一滴水，用灭菌接种环取少量的病变组织，均匀涂布在水中；持载玻片于酒精灯火焰上方，蒸干水分，进行固定；涂片用结晶紫初染，1分钟后水洗；用碘液媒染，1分钟后水洗，用95%的乙醇脱色，30秒后水洗；以沙黄复染30秒，水洗；待标本干燥后，置于光学显微镜下观察。
1．2．4 血清学检测
采用酶联免疫吸附法（ELISA）对PCV2、PPV、PRV、JEV进行血清学抗体检测，根据武汉科前动物生物制品有限责任公司ELISA试剂盒说明书提供的步骤进行操作，具体方法如下：
向抗原包被板的所有孔中加入200μl稀释好的洗涤液，静置3分钟，之后倒出液体，于吸水纸上拍干，共2次。再取稀释好的待测血清100μl，做1孔，取阳性对照和阴性对照，各做2孔，每孔100μl，分别加至抗原包被板中。轻轻振摇包被板，在37℃下孵育30分钟； 甩掉孔中的液体，再加入稀释好的洗涤液，每个孔200μl，静置3分钟，甩掉，然后于吸水纸上拍干，共5次；向每个孔中加入羊抗猪酶标二抗100μl，在37℃下孵育30分钟；洗五次，方法如上所述；向每个孔中先后加入底物液A和底物液B各50μl，混匀后在室温下进行避光显色，10分钟后向每个孔中加入终止液50μl，于10分钟内完成结果测定。用酶标分析仪测定各个孔的OD630值。猪圆环病毒II型：当阳性对照孔平均OD630值大于或等于0.7，阴性对照孔平均OD630值小于0.3时，试验成立；当样品OD630 值大于0.42时，判定为阳性，当OD630值大于或等于0.38而小于或等于0.42时，判定为可疑，当OD630值小于0.38时，判定为阴性。细小病毒：当阳性对照孔平均OD630值大于或等于0.6，阴性对照孔平均OD630值小于0.3时，试验成立；当样品OD630值大于或等于0.4时，判定为阳性，当样品OD630值小于0.4时，判定为阴性。伪狂犬病病毒：当阳性对照孔和阴性对照孔的平均OD630值之差大于或等于0.4时，试验成立；S代表样品孔OD630值，N代表阴性对照孔平均OD630值，当S/N值小于或等于0.6时，判定为阳性，当S/N值大于0.6而小于或等于0.7时，必须重新测定样本。若结果仍在此范围内，则须在一段时间后，重新对动物体采样和检测，当S/N值大于0.7时，判定为阴性。日本乙型脑炎病毒：当阳性对照孔平均OD630值大于或等于1，阴性对照孔平均OD630值小于0.2时，试验成立；S代表样品孔OD630值，P代表阳性对照孔平均OD630值，计算 S/P值，当S/P值大于或等于0.21时，判定为阳性，当S/P值小于0.21时，判定为阴性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1□材料与方法2
1.1□材料 2
1.1.1□病料来源2
1.1.2□主要试剂2
1.1.3□主要仪器2
1.2□方法 2
1.2.1□发病情况2
1.2.2□病理剖检2
1.2.3□细菌学检测3
1.2.4□血清学检测3
1.2.5□分子生物学检测3
2□结果与分析5
2.1□病理变化5
2.2□细菌学检查5
2.3□血清学检测结果6
2.4□分子生物学检测结果6
2.5□治疗与转归7
2.5.1□隔离消毒7
2.5.2□治疗用药7
2.5.3□转归情况7
3□讨论8
3.1□心得体会8
3.2□预防措施8
3.2.1□免疫接种8
3.2.2□疾病净化8
3.2.3□消毒杀虫8
3.2.4□管理方式9
3.2.5□营养水平9
致谢9
参考文献9
重庆市某猪场猪四种病毒性疫病混合感染的鉴定
引言
混合感染由两种或两种以上的病原微生物同时参与[1]。通常引起混合感染的病原体类型为病毒、细菌、支原体和寄生虫等，各种病原体构成的组合多种多样，其中较为流行的疾病有猪呼吸道疾病综合征、猪高热综合征等[24]。多种病原体混合感染往往造成高的发病率和死亡率
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
，并且症状复杂而不典型，给兽医工作者的诊断和防治带来了巨大挑战。
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2， PCV2) 具有免疫抑制性，能够诱发多种病原体混合感染，可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、猪呼吸道疾病综合征、猪皮炎和肾病综合征等多种疾病[5，6]；猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)能引起初产母猪繁殖障碍，主要特征是导致母猪受孕失败，延迟发情，发生流产、死胎、胎儿木乃伊化及新生仔猪的死亡[7，8]；猪感染伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)的症状因日龄而异，仔猪常表现神经症状，育肥猪和成年猪常表现呼吸症状，母猪则表现为返情，屡配不孕，妊娠母猪流产，产出死胎或木乃伊胎，而公猪通常发生睾丸肿胀或者睾丸萎缩 [911]；日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)是一种重要的人畜共患病病原，可使怀孕母猪流产、产木乃伊胎或畸形胎，公猪出现睾丸炎，丧失繁殖能力，仔猪出现神经症状甚至在几日内死亡[12]。目前较少有关于PCV2、PPV、PRV、JEV混合感染的报道，本文通过对一起猪繁殖障碍性疾病进行诊断与治疗，可为进一步研究PCV2、PPV、PRV、JEV混合感染的防治方法提供可行性建议和借鉴经验。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 病料来源
重庆市某猪场患病猪群中选出20只进行临床诊断和实验室诊断。
1．1．2 主要试剂
作为阳性对照的猪圆环病毒II型、细小病毒、伪狂犬病毒、日本乙型脑炎病毒由重庆市动物疫病预防控制中心保存，革兰氏染液由重庆市动物疫病预防控制中心提供，猪圆环病毒II型、细小病毒、伪狂犬病毒、日本乙型脑炎病毒的抗体检测试剂盒均购自武汉科前动物生物制品有限责任公司，DNA抽提试剂盒和RNA抽提试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司，PCR试剂盒、RTPCR试剂盒以及DNA Marker 购自TaKaRa公司，其他试剂均为进口或国产分析纯。
1．1．3 主要仪器
光学显微镜、分光光度计、离心机、涡旋混匀器、电热水浴锅、PCR仪、核酸胶电泳槽、凝胶图像分析仪等。
1．2 方法
1．2．1 发病情况
重庆市某猪场现存栏700余头，已预防接种过猪瘟、猪丹毒、猪肺疫以及猪繁殖与呼吸综合征疫苗。自2015年4月，该猪场陆续发现30余头母猪发生繁殖障碍，发病母猪流产或产下死胎、弱胎和少数木乃伊胎，经产母猪与初产母猪的发病率相差不大。存活的新生仔猪精神不振，食欲减退，体温41～42℃，常突然发病，呕吐，腹泻，口角流出泡沫样唾液，发抖甚至痉挛，行走不稳，运动不协调，呈后退、转圈运动，发病率和死亡率都很高。曾使用过青霉素、链霉素及磺胺类药物，均无明显疗效。
1．2．2 病理剖检
选择三头症状典型的病猪进行剖检，具体方法为：先进行外部检查，如可视粘膜颜色、皮肤有无异常、淋巴结是否肿胀等；之后取背卧位固定尸体，剖开腹腔，检查胃、肠、肝、胆、脾、肾、膀胱等脏器；再剖开胸腔，检查心、肺；最后剖开颅腔，摘出大脑进行检查，并记录结果。
1．2．3 细菌学检测
采集病猪组织脏器，按常规方法进行涂片，采用革兰氏染色法进行染色，之后镜检，具体步骤如下:在一片干净的载玻片上滴一滴水，用灭菌接种环取少量的病变组织，均匀涂布在水中；持载玻片于酒精灯火焰上方，蒸干水分，进行固定；涂片用结晶紫初染，1分钟后水洗；用碘液媒染，1分钟后水洗，用95%的乙醇脱色，30秒后水洗；以沙黄复染30秒，水洗；待标本干燥后，置于光学显微镜下观察。
1．2．4 血清学检测
采用酶联免疫吸附法（ELISA）对PCV2、PPV、PRV、JEV进行血清学抗体检测，根据武汉科前动物生物制品有限责任公司ELISA试剂盒说明书提供的步骤进行操作，具体方法如下：
向抗原包被板的所有孔中加入200μl稀释好的洗涤液，静置3分钟，之后倒出液体，于吸水纸上拍干，共2次。再取稀释好的待测血清100μl，做1孔，取阳性对照和阴性对照，各做2孔，每孔100μl，分别加至抗原包被板中。轻轻振摇包被板，在37℃下孵育30分钟； 甩掉孔中的液体，再加入稀释好的洗涤液，每个孔200μl，静置3分钟，甩掉，然后于吸水纸上拍干，共5次；向每个孔中加入羊抗猪酶标二抗100μl，在37℃下孵育30分钟；洗五次，方法如上所述；向每个孔中先后加入底物液A和底物液B各50μl，混匀后在室温下进行避光显色，10分钟后向每个孔中加入终止液50μl，于10分钟内完成结果测定。用酶标分析仪测定各个孔的OD630值。猪圆环病毒II型：当阳性对照孔平均OD630值大于或等于0.7，阴性对照孔平均OD630值小于0.3时，试验成立；当样品OD630 值大于0.42时，判定为阳性，当OD630值大于或等于0.38而小于或等于0.42时，判定为可疑，当OD630值小于0.38时，判定为阴性。细小病毒：当阳性对照孔平均OD630值大于或等于0.6，阴性对照孔平均OD630值小于0.3时，试验成立；当样品OD630值大于或等于0.4时，判定为阳性，当样品OD630值小于0.4时，判定为阴性。伪狂犬病病毒：当阳性对照孔和阴性对照孔的平均OD630值之差大于或等于0.4时，试验成立；S代表样品孔OD630值，N代表阴性对照孔平均OD630值，当S/N值小于或等于0.6时，判定为阳性，当S/N值大于0.6而小于或等于0.7时，必须重新测定样本。若结果仍在此范围内，则须在一段时间后，重新对动物体采样和检测，当S/N值大于0.7时，判定为阴性。日本乙型脑炎病毒：当阳性对照孔平均OD630值大于或等于1，阴性对照孔平均OD630值小于0.2时，试验成立；S代表样品孔OD630值，P代表阳性对照孔平均OD630值，计算 S/P值，当S/P值大于或等于0.21时，判定为阳性，当S/P值小于0.21时，判定为阴性。
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