硫酸化黄芪多糖对小鼠未成熟树突状细胞增殖的影响
硫酸化黄芪多糖对小鼠未成熟树突状细胞增殖的影响[20200507220001]
摘要：黄芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）及其衍生物具有良好的体内外免疫增强作用，能提高动物的体液免疫和细胞免疫。前期研究表明，研究发现, 有些多糖本来无抗病毒活性或抗病毒活性较低, 经硫酸化修饰后有抗病毒活性或活性增强[1]。黄芪多糖、硫酸化黄芪多糖具有良好的免疫促进作用[2]。树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）是动物体内重要的抗原提呈细胞。未成熟的DCs具有较强的抗原提呈能力，成熟后其释放细胞因子、协助淋巴细胞参与机体细胞免疫的能力增强，因此DCs有望成为治疗免疫系统疾病的药物靶标和筛选模型。本实验在前期研究的基础上制备硫酸化黄芪多糖，再研究其对小鼠未成熟树突状细胞增殖的作用[3-4]。研究首先采用水提醇沉、三氯乙酸去蛋白、DEAE柱层析的方法制备均一性黄芪中性多糖，再使用氯磺酸-吡啶法将其制备为硫酸化黄芪多糖，最后用MTT法研究黄芪多糖体外对未成熟小鼠髓源树突状细胞（mBM-DCs）的增殖作用。本研究为研究硫酸化提高黄芪多糖的免疫增强活性提供基础，为构建以mBM-DCs为靶细胞的药物筛选模型提供依据。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
关键字:黄芪多糖；硫酸化多糖；树突状细胞
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料与方法4
1.1材料4
1.2方法4
1.2.1黄芪多糖的制备4
1.2.1.1黄芪粗多糖的提取4
1.2.1.2 黄芪粗多糖去蛋白5
1.2.1.3黄芪多糖的柱层析纯化5
1.2.2 硫酸化黄芪多糖的制备5
1.2.3 研究硫酸化黄芪多糖对小鼠未成熟DCs功能的5
1.2.3.1 小鼠DCs 的分离与培养5
1.2.3.2 MTT法测定黄芪多糖及硫酸化黄芪多糖对未成熟DCs的增殖作6
1.3 数据分析6
2结果与分析6
2.1 黄芪多糖的提取率6
2.2 标准葡萄糖溶液曲线以及DEAE层析柱得到的黄芪多糖溶液的曲6
2.3树突状细胞诱导培养过程中细胞形态的变化7
2.4 硫酸化黄芪多糖对未成熟小鼠骨髓树突状细胞增殖的影响7
3讨论8
致谢8
参考文献9
图1葡萄糖标准溶液吸光度曲线6
图2自动收集器中每管黄芪多糖吸光度6
图 3硫酸化黄芪多糖作用小鼠未成熟树突状细胞后6天内的生长状况7
图4 MTT法不同剂量药物作用小鼠未成熟树突状细胞后的OD值7
表1 硫酸化黄芪多糖对未成熟树突状细胞的作用7
硫酸化黄芪多糖对小鼠未成熟树突状细胞增殖的影响
引言
黄芪作为传统中药，其药味甘性温，归肺、脾经，具有益气升阳、固表止汗、利水消肿、托毒生肌之功效 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
，传统上用于治疗内伤劳倦、脾虚泄泻、肺虚咳嗽、脱肛、子宫脱垂、便血、崩漏、盗汗及一切气虚血亏之症，其补益作用显著，疗效确切。
树突状细胞(Dendritic cells, DCs）是机体功能最强的专职抗原递呈细胞 (Antigen presenting cells, APCs)，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DCs具有较强的迁移能力，成熟DCs能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答 的中心环节[5]。DCs是功能强大的专职抗原递呈细胞 (APCs)。DCs自身具有免疫刺激能力，是目前发现的惟一能激活未致敏的初始型T细胞 的APCs。研究发现，中药的多糖成分能够从促进DCs前体增殖、增强DCs 活化并促进T淋巴细胞增殖，并具有增强DCs提呈抗原等方面影响DCs的功能。此外，研究发现，硫酸化黄芪多糖和硒化党参多糖能够具有增强机体细胞免疫和体液免疫功能、促进细胞因子的释放、增强免疫细胞活性、提高抗体水平等活性，在提高机体免疫功能、病毒防治及肿瘤治疗等当面发挥着及其重要的作用，是一种良好的免疫促进剂[6]。基于多糖、衍生化多糖及DCs在调节机体免疫系统方面存在密切联系，本实验在前期工作的基础上，研究黄芪多糖及其硫酸化产物对DCs功能的调节作用。
1 材料与方法
1．1 材料
药材：黄芪（购自丰原药业）。
实验动物：昆明种小鼠（清洁级）。
试剂：乙醇、 NaOH、三氯乙酸、DEAE、NaCl、硫酸、苯酚、NaCO3、亚硒酸钠、硒标准储备液、高氯酸、浓硝酸、浓盐酸、无水乙醇，胎牛血清，刺激因子GM-CSF，汉克斯液 ，1640营养液：按照实验室方法配制。
器材：三颈瓶、玻璃离心管、玻璃塞、玻璃棒、层析柱，烧杯，试管（10mL、15mL）、三角瓶、培养皿、注射器（1ml,5ml）、剪刀、镊子、ep管、盐水瓶、橡胶塞、吸管、胶头、酒精棉球、酒精灯、6孔细胞板、纱布、青霉素瓶。
设备：旋转蒸发仪，电子称量仪、离心机、电热煲、超声波裂解仪、自动部分收集器，恒流泵、水浴锅，细胞培养箱，细胞计数板，显微镜
1．2 方法
1．2．1 黄芪多糖的制备
1.2.1.1 黄芪粗多糖的提取
取黄芪饮片897.30g，55℃鼓风干燥箱中干燥12h后粉碎，用适量（以刚好淹没黄芪饮片碎粒为宜）无水乙醇浸泡过夜，然后加入95%乙醇3L水浴加热，回流三次，每次两小时，至回流液接近无色，药渣晾干，第一次加入8倍水煎煮一次，回收煎煮液后加入6倍水煎煮两次，回收煎煮液，每次两小时，合并滤液，浓缩至500ml，缓慢加入95%乙醇，边加边搅拌，使乙醇终浓度达到80%，静置过夜（如颜色较深可再醇沉一次），抽滤，滤饼置60℃烘干，得到黄芪粗多糖。
1.2.1.2 黄芪粗多糖去蛋白 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
/> 采用三氯乙酸法去蛋白。每次称取粗黄芪多糖20g多糖，粉碎，加入400ml水，60℃水浴加热，超声使之完全溶解。向该溶液中加入10%的氢氧化钠溶液调节PH至7，再加入3%的三氯乙酸使之占溶液浓度的7.5%，在4℃下静置4小时，3000rpm离心20min，重复6次去除蛋白，以达到最大限度除去蛋白质的效果。去离心过后的多糖溶液，使用旋转蒸发仪浓缩，冻干后，得到23.57g去蛋白黄芪多糖。
1.2.1.3 黄芪多糖的柱层析纯化
称取填料DEAE-52 40g，用去离子水浸泡过夜，装入层析柱中，装好后平衡24小时，并用蒸馏水通过恒流泵流入柱子当中，将柱子压实。将黄芪多糖配成0.1g／ml的溶液，每次上样量为5ml。用蒸馏水匀速洗脱多糖，自动收集仪收集洗脱液，每10mL作为一个流份，收集30-40个流份。采用浓硫酸-苯酚法测定每个流份的糖含量，绘制洗脱液糖含量曲线图，合并，旋转蒸发仪浓缩，浓缩液冻干得到精制总黄芪多糖8.93g。
1．2．2 硫酸化黄芪多糖的制备
根据课题组已有工艺，采用氯磺酸-吡啶法制备硫酸化黄芪多糖[7]。首先制备酯化试剂，将带有搅拌装置和冷凝装置的三颈烧瓶置盐水冰浴中，加入预冷的无水吡啶25ml，激烈搅拌，使之充分冷却，逐滴加入4.2ml氯磺酸，于40min内加完，待烧瓶中出现大量淡黄色固体时终止反应。精密称取待修饰多糖400mg，加入盛有酯化试剂烧瓶中，95℃水浴中加热搅拌1h。反应结束后冷却至室温，反应液加入100ml冰水中，用饱和的NaOH溶液中和至PH7.5，再加入3倍体积的无水乙醇，静置24h。取沉淀用自来水透析2d，蒸馏水透析1d。透析液经冷冻干燥，得硫酸化的黄芪多糖（sAPS）。
1．2．3 研究硫酸化黄芪多糖对小鼠未成熟DCs功能的作用
1．2．3．1 小鼠DCs 的分离与培养
小鼠mBM-DCs的分离小鼠用颈部断髓法处死，用75%酒精浸泡消毒 5 min，无菌取出股骨与胫骨,用hanks液清洗1次,再用含胎牛血清的1640培养液冲洗2次。剪去骨两端,再用无菌注射器抽取1640培养液冲洗骨髓腔3次，将骨髓细胞冲洗到培养皿中,吹打。将收集的骨髓细胞用转速1500×g离心机离心15min，去上清液，加入预温的0.83%Tris-NH4Cl裂解液5mL,裂解红细胞 3 min，然后加入等体积的1640完全培养基，充分混匀，终止裂解反应，用转速1500×g离心机离心8min,去上清液，再加入含胎牛血清的1640完全培养基10mL混匀，用转速1500×g离心机离心8min，去上清液[7]。
摘要：黄芪多糖（Astragalus polysaccharides，APS）及其衍生物具有良好的体内外免疫增强作用，能提高动物的体液免疫和细胞免疫。前期研究表明，研究发现, 有些多糖本来无抗病毒活性或抗病毒活性较低, 经硫酸化修饰后有抗病毒活性或活性增强[1]。黄芪多糖、硫酸化黄芪多糖具有良好的免疫促进作用[2]。树突状细胞（Dendritic Cells，DCs）是动物体内重要的抗原提呈细胞。未成熟的DCs具有较强的抗原提呈能力，成熟后其释放细胞因子、协助淋巴细胞参与机体细胞免疫的能力增强，因此DCs有望成为治疗免疫系统疾病的药物靶标和筛选模型。本实验在前期研究的基础上制备硫酸化黄芪多糖，再研究其对小鼠未成熟树突状细胞增殖的作用[3-4]。研究首先采用水提醇沉、三氯乙酸去蛋白、DEAE柱层析的方法制备均一性黄芪中性多糖，再使用氯磺酸-吡啶法将其制备为硫酸化黄芪多糖，最后用MTT法研究黄芪多糖体外对未成熟小鼠髓源树突状细胞（mBM-DCs）的增殖作用。本研究为研究硫酸化提高黄芪多糖的免疫增强活性提供基础，为构建以mBM-DCs为靶细胞的药物筛选模型提供依据。
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关键字:黄芪多糖；硫酸化多糖；树突状细胞
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料与方法4
1.1材料4
1.2方法4
1.2.1黄芪多糖的制备4
1.2.1.1黄芪粗多糖的提取4
1.2.1.2 黄芪粗多糖去蛋白5
1.2.1.3黄芪多糖的柱层析纯化5
1.2.2 硫酸化黄芪多糖的制备5
1.2.3 研究硫酸化黄芪多糖对小鼠未成熟DCs功能的5
1.2.3.1 小鼠DCs 的分离与培养5
1.2.3.2 MTT法测定黄芪多糖及硫酸化黄芪多糖对未成熟DCs的增殖作6
1.3 数据分析6
2结果与分析6
2.1 黄芪多糖的提取率6
2.2 标准葡萄糖溶液曲线以及DEAE层析柱得到的黄芪多糖溶液的曲6
2.3树突状细胞诱导培养过程中细胞形态的变化7
2.4 硫酸化黄芪多糖对未成熟小鼠骨髓树突状细胞增殖的影响7
3讨论8
致谢8
参考文献9
图1葡萄糖标准溶液吸光度曲线6
图2自动收集器中每管黄芪多糖吸光度6
图 3硫酸化黄芪多糖作用小鼠未成熟树突状细胞后6天内的生长状况7
图4 MTT法不同剂量药物作用小鼠未成熟树突状细胞后的OD值7
表1 硫酸化黄芪多糖对未成熟树突状细胞的作用7
硫酸化黄芪多糖对小鼠未成熟树突状细胞增殖的影响
引言
黄芪作为传统中药，其药味甘性温，归肺、脾经，具有益气升阳、固表止汗、利水消肿、托毒生肌之功效 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
，传统上用于治疗内伤劳倦、脾虚泄泻、肺虚咳嗽、脱肛、子宫脱垂、便血、崩漏、盗汗及一切气虚血亏之症，其补益作用显著，疗效确切。
树突状细胞
1 材料与方法
1．1 材料
药材：黄芪（购自丰原药业）。
实验动物：昆明种小鼠（清洁级）。
试剂：乙醇、 NaOH、三氯乙酸、DEAE、NaCl、硫酸、苯酚、NaCO3、亚硒酸钠、硒标准储备液、高氯酸、浓硝酸、浓盐酸、无水乙醇，胎牛血清，刺激因子GM-CSF，汉克斯液 ，1640营养液：按照实验室方法配制。
器材：三颈瓶、玻璃离心管、玻璃塞、玻璃棒、层析柱，烧杯，试管（10mL、15mL）、三角瓶、培养皿、注射器（1ml,5ml）、剪刀、镊子、ep管、盐水瓶、橡胶塞、吸管、胶头、酒精棉球、酒精灯、6孔细胞板、纱布、青霉素瓶。
设备：旋转蒸发仪，电子称量仪、离心机、电热煲、超声波裂解仪、自动部分收集器，恒流泵、水浴锅，细胞培养箱，细胞计数板，显微镜
1．2 方法
1．2．1 黄芪多糖的制备
1.2.1.1 黄芪粗多糖的提取
取黄芪饮片897.30g，55℃鼓风干燥箱中干燥12h后粉碎，用适量（以刚好淹没黄芪饮片碎粒为宜）无水乙醇浸泡过夜，然后加入95%乙醇3L水浴加热，回流三次，每次两小时，至回流液接近无色，药渣晾干，第一次加入8倍水煎煮一次，回收煎煮液后加入6倍水煎煮两次，回收煎煮液，每次两小时，合并滤液，浓缩至500ml，缓慢加入95%乙醇，边加边搅拌，使乙醇终浓度达到80%，静置过夜（如颜色较深可再醇沉一次），抽滤，滤饼置60℃烘干，得到黄芪粗多糖。
1.2.1.2 黄芪粗多糖去蛋白
/> 采用三氯乙酸法去蛋白。每次称取粗黄芪多糖20g多糖，粉碎，加入400ml水，60℃水浴加热，超声使之完全溶解。向该溶液中加入10%的氢氧化钠溶液调节PH至7，再加入3%的三氯乙酸使之占溶液浓度的7.5%，在4℃下静置4小时，3000rpm离心20min，重复6次去除蛋白，以达到最大限度除去蛋白质的效果。去离心过后的多糖溶液，使用旋转蒸发仪浓缩，冻干后，得到23.57g去蛋白黄芪多糖。
1.2.1.3 黄芪多糖的柱层析纯化
称取填料DEAE-52 40g，用去离子水浸泡过夜，装入层析柱中，装好后平衡24小时，并用蒸馏水通过恒流泵流入柱子当中，将柱子压实。将黄芪多糖配成0.1g／ml的溶液，每次上样量为5ml。用蒸馏水匀速洗脱多糖，自动收集仪收集洗脱液，每10mL作为一个流份，收集30-40个流份。采用浓硫酸-苯酚法测定每个流份的糖含量，绘制洗脱液糖含量曲线图，合并，旋转蒸发仪浓缩，浓缩液冻干得到精制总黄芪多糖8.93g。
1．2．2 硫酸化黄芪多糖的制备
根据课题组已有工艺，采用氯磺酸-吡啶法制备硫酸化黄芪多糖[7]。首先制备酯化试剂，将带有搅拌装置和冷凝装置的三颈烧瓶置盐水冰浴中，加入预冷的无水吡啶25ml，激烈搅拌，使之充分冷却，逐滴加入4.2ml氯磺酸，于40min内加完，待烧瓶中出现大量淡黄色固体时终止反应。精密称取待修饰多糖400mg，加入盛有酯化试剂烧瓶中，95℃水浴中加热搅拌1h。反应结束后冷却至室温，反应液加入100ml冰水中，用饱和的NaOH溶液中和至PH7.5，再加入3倍体积的无水乙醇，静置24h。取沉淀用自来水透析2d，蒸馏水透析1d。透析液经冷冻干燥，得硫酸化的黄芪多糖（sAPS）。
1．2．3 研究硫酸化黄芪多糖对小鼠未成熟DCs功能的作用
1．2．3．1 小鼠DCs 的分离与培养
小鼠mBM-DCs的分离小鼠用颈部断髓法处死，用75%酒精浸泡消毒 5 min，无菌取出股骨与胫骨,用hanks液清洗1次,再用含胎牛血清的1640培养液冲洗2次。剪去骨两端,再用无菌注射器抽取1640培养液冲洗骨髓腔3次，将骨髓细胞冲洗到培养皿中,吹打。将收集的骨髓细胞用转速1500×g离心机离心15min，去上清液，加入预温的0.83%Tris-NH4Cl裂解液5mL,裂解红细胞 3 min，然后加入等体积的1640完全培养基，充分混匀，终止裂解反应，用转速1500×g离心机离心8min,去上清液，再加入含胎牛血清的1640完全培养基10mL混匀，用转速1500×g离心机离心8min，去上清液[7]。
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