锌和海藻糖对热应激大鼠睾丸间质细胞的缓解作用
目的探究锌和海藻糖对热应激大鼠睾丸间质细胞的作用。方法建立原代大鼠睾丸间质细胞体外培养，添加海藻糖（100 mmol/L）、氯化锌（400 μmol /L）、TPEN（15 μmol/L）和DMEM培养液并进行热处理（39 oC，5% CO2，2h），热处理后进行细胞增值率（MTT法）和细胞氧化损伤水平（MDA法）测定。结果进行预试验确定正式试验添加的海藻糖浓度（100 mmol/L）与氯化锌浓度（400 μmol /L）；噻唑兰（MTT）结果显示相同处理组经热处理后细胞活力均下降（p < 0.05），热处理前各组细胞增值率两两对比差别极显著（p < 0.001），热处理后各组细胞增值率两两对比差异极显著（p < 0.001），且组间对比在热处理前后均为DMEM组 > 海藻糖组 > 氯化锌组 > TPEN组；丙二醛（MDA）测定结果显示热处理后各组间差异不显著（p>0.05）。结论海藻糖对热应激抑制大鼠睾丸间质细胞生长具有一定的缓解作用。400 μmol/L的氯化锌会加剧热应激对细胞的损伤。海藻糖对热应激处理睾丸间质细胞损伤的缓解作用好于锌。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 3
1.2.1试验设计3
1.2.2分离提取大鼠睾丸间质细胞3
1.2.3睾丸间质细胞处理3
1.2.4细胞增值率测定（MTT法）3
1.2.5 细胞氧化程度测定（MDA法）4
1.3数据分析4
2结果4
2.1大鼠睾丸间质细胞体外培养建立4
2.2不同浓度海藻糖对细胞增值率的影响4
2.3不同浓度ZnCl2对细胞增值率的影响4
2.4不同处理对细胞增值率的影响5
2.5不同处理对细胞氧化损伤的影响5
3讨论 6
4结论 7
致谢7
参考文献7
锌和海藻糖对热应激大鼠睾丸间质细胞的缓解作用
引言
热应激是动物在高于等热区上限温 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
度的环境下发生的一系列非特异性生理反应的总称。在热应激状态下，雄性动物阴囊和睾丸的热调节能力失去作用，睾丸的生精机能受到损害，抑制了精子的发生，异常精子数明显增多，造成了热应激状态下精液品质严重下降[1]。桑润滋等[2]（1999）报道热应激使种公牛原精活力、冻精活力、精子密度、活精子百分数和顶体完整率分别比春季下降3.13%、1.11%、34.8%、15.0%和17.8%，精子畸形率比春季上升255%。田允波（2003）[3]测定分析了冷冻精子顶体完整率的季节性变化，发现8、9月顶体完整率最低，分别为30.44%和32.75%。Terawaki等[4]（1997）报道在8月份高温环境下，活精子数与有完整顶体的活精子仅为76.7%与72.7%，在全年各月份中水平最低。热应激引起的动物繁殖力的降低会造成严重的经济损失。
一般认为，热应激能够诱导O2、OH等自由基的产生，导致细胞膜内脂质过氧化物的生成，引起氧化应激，从而造成机体不同部位的氧化损伤[5]。自由基团进入细胞内会造成蛋白质的异常卷曲、折叠，发生变性，当变性蛋白质蓄积到一定程度时细胞就无法正常发挥功能发生细胞凋亡[6,7]。并且在持续的高温刺激后，自由基水平仍会继续增加，进而影响细胞正常的生理功能[5,810]。如何能够降低自由基的氧化损伤，或者能够对受到氧化刺激后的细胞进行处理是抗热应激研究的主要方向。
海藻糖（trehalose）是一种在微生物、植物和昆虫中广泛合成的二糖类物质，鼠类与人类均含有海藻糖酶，可以分解海藻糖提供能量，海藻糖也可以经过一定的途径使海藻糖发挥其他作用。有报道称，海藻糖可以在热刺激条件下与细胞膜结合形成玻璃态，当热刺激解除后，海藻糖处理过的细胞 膜可以很快的“复水化”继续发挥作用[12]。另外，海藻糖可以有效提高自噬水平，清除变性蓄积的蛋白质，使细胞功能得以正常运转[1315]。但是还没有相关报道证明海藻糖与热应激处理睾丸间质细胞的直接关系，根据已有试验有理由推断海藻糖也会对其产生一定的良性作用。
作为一种必需微量元素，锌与300多种生物酶的结构和活性的调节作用有关,构成了这些酶的辅酶或辅基[16,17]。当机体处于热应激环境时，细胞液中的锌含量大幅降低，肝脏中的锌含量激增为原来的四倍，说明锌的需要量在热应激状态下会升高，机体处于一个相对缺锌的状态[18,19]。缺锌会降低机体中透明质酸酶、乳酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、碱性磷酸酶、腺苷酸环化酶、酸性磷酸酶、等与繁殖相关的酶的活性，而这些酶对雄性动物的睾丸、精子产生有重要的影响[20]。除此之外，锌还具有结合自由基的能力[17]，可以有效降低热应激引起的自由基损伤，添加锌元素可以起到良好的抗热应激作用[19]，但具体的浓度还需要进一步的探索。
在体外培养的睾丸间质细胞中加入海藻糖、锌、以及锌元素螯合物TPEN并进行热刺激，比对细胞活性、异常蛋白数量和自噬水平等各项指标，可以研究海藻糖和锌是否可以缓解热应激对睾丸间质细胞的影响。以期为海藻糖作为抗热应激物质的研发提供一些信息。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验动物：选用14周龄雄性SpragueDawley（SD）大鼠（购自南京青龙山实验动物中心）12只，4只用于预试验确定海藻糖与氯化锌培养液浓度，8只用于正式试验。试验动物饲养于大学动物科技学院试验动物饲养中心，温度25 °C，湿度50% ± 5%，光/暗周期为12 h / 12 h，自由采食和饮水。正式试验前饲养一周观察其健康状况。试验操作按照大学动物护理委员会编写的试验动物护理和使用指南进行。
试验试剂：胶原酶Ⅱ为Sigma公司产品；Dulbeccos Modified eagles MediumHams F12 Medium (DMEMF12 medium)培养基、新生牛血清、青霉素和链霉素为美国Gibco公司产品；微量MDA、MTT试剂盒为南京建成生物工程研究所产品；海藻糖（Dtrehalose，无水）、氯化锌（分析纯）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司。
试验仪器：倒置显微镜、CO2培养箱、外科手术器械等由大学动物科技学院生殖生理实验室提供；分光光度计由大学动物科技学院实验中心提供。
1.2 方法
1.2.1 试验设计
预试验1：选取4只14周龄健康雄性大鼠，处死后提取睾丸间质细胞于96孔板上进行细胞培养（37 oC，5% CO2），24 h后吸出原培养液，加入等体积不同浓度的海藻糖培养液（0, 10, 100, 200, 400 mmol/L），又24 h后进行热应激（39 °C，2 h），检测细胞活力，比对选取效果抗热应激最显著的海藻糖浓度。
预试验2：加入不同浓度的氯化锌培养液（0, 100, 200, 400, 800, 1000 μmol/L），操作同上。
主试验：选取8只14周龄健康雄性大鼠，分为热处理组（T组）与对照组（CT组），每组分为4个处理（100 mmol/L海藻糖组、400 μmol/L氯化锌组、15 μmol/L TPEN组和DMEM组）其余操作同上。
1.2.2 分离提取睾丸间质细胞
（1）处死大鼠
采用颈部脱臼法迅速处死大鼠，转移至无菌操作间内进行手术操作。
（2）无菌采集睾丸
在PBS培养液中去除被膜和血管，打散睾丸实质，放入纯DMEM培养基中。
（3）酶解睾丸间质组织
在培养基中加入I型胶原酶（浓度：10 mg/mL），在34 °C水浴条件下震荡（确保培养液在30 mL以上）。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 3
1.2.1试验设计3
1.2.2分离提取大鼠睾丸间质细胞3
1.2.3睾丸间质细胞处理3
1.2.4细胞增值率测定（MTT法）3
1.2.5 细胞氧化程度测定（MDA法）4
1.3数据分析4
2结果4
2.1大鼠睾丸间质细胞体外培养建立4
2.2不同浓度海藻糖对细胞增值率的影响4
2.3不同浓度ZnCl2对细胞增值率的影响4
2.4不同处理对细胞增值率的影响5
2.5不同处理对细胞氧化损伤的影响5
3讨论 6
4结论 7
致谢7
参考文献7
锌和海藻糖对热应激大鼠睾丸间质细胞的缓解作用
引言
热应激是动物在高于等热区上限温 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
度的环境下发生的一系列非特异性生理反应的总称。在热应激状态下，雄性动物阴囊和睾丸的热调节能力失去作用，睾丸的生精机能受到损害，抑制了精子的发生，异常精子数明显增多，造成了热应激状态下精液品质严重下降[1]。桑润滋等[2]（1999）报道热应激使种公牛原精活力、冻精活力、精子密度、活精子百分数和顶体完整率分别比春季下降3.13%、1.11%、34.8%、15.0%和17.8%，精子畸形率比春季上升255%。田允波（2003）[3]测定分析了冷冻精子顶体完整率的季节性变化，发现8、9月顶体完整率最低，分别为30.44%和32.75%。Terawaki等[4]（1997）报道在8月份高温环境下，活精子数与有完整顶体的活精子仅为76.7%与72.7%，在全年各月份中水平最低。热应激引起的动物繁殖力的降低会造成严重的经济损失。
一般认为，热应激能够诱导O2、OH等自由基的产生，导致细胞膜内脂质过氧化物的生成，引起氧化应激，从而造成机体不同部位的氧化损伤[5]。自由基团进入细胞内会造成蛋白质的异常卷曲、折叠，发生变性，当变性蛋白质蓄积到一定程度时细胞就无法正常发挥功能发生细胞凋亡[6,7]。并且在持续的高温刺激后，自由基水平仍会继续增加，进而影响细胞正常的生理功能[5,810]。如何能够降低自由基的氧化损伤，或者能够对受到氧化刺激后的细胞进行处理是抗热应激研究的主要方向。
海藻糖（trehalose）是一种在微生物、植物和昆虫中广泛合成的二糖类物质，鼠类与人类均含有海藻糖酶，可以分解海藻糖提供能量，海藻糖也可以经过一定的途径使海藻糖发挥其他作用。有报道称，海藻糖可以在热刺激条件下与细胞膜结合形成玻璃态，当热刺激解除后，海藻糖处理过的细胞 膜可以很快的“复水化”继续发挥作用[12]。另外，海藻糖可以有效提高自噬水平，清除变性蓄积的蛋白质，使细胞功能得以正常运转[1315]。但是还没有相关报道证明海藻糖与热应激处理睾丸间质细胞的直接关系，根据已有试验有理由推断海藻糖也会对其产生一定的良性作用。
作为一种必需微量元素，锌与300多种生物酶的结构和活性的调节作用有关,构成了这些酶的辅酶或辅基[16,17]。当机体处于热应激环境时，细胞液中的锌含量大幅降低，肝脏中的锌含量激增为原来的四倍，说明锌的需要量在热应激状态下会升高，机体处于一个相对缺锌的状态[18,19]。缺锌会降低机体中透明质酸酶、乳酸脱氢酶、乙醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、碱性磷酸酶、腺苷酸环化酶、酸性磷酸酶、等与繁殖相关的酶的活性，而这些酶对雄性动物的睾丸、精子产生有重要的影响[20]。除此之外，锌还具有结合自由基的能力[17]，可以有效降低热应激引起的自由基损伤，添加锌元素可以起到良好的抗热应激作用[19]，但具体的浓度还需要进一步的探索。
在体外培养的睾丸间质细胞中加入海藻糖、锌、以及锌元素螯合物TPEN并进行热刺激，比对细胞活性、异常蛋白数量和自噬水平等各项指标，可以研究海藻糖和锌是否可以缓解热应激对睾丸间质细胞的影响。以期为海藻糖作为抗热应激物质的研发提供一些信息。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验动物：选用14周龄雄性SpragueDawley（SD）大鼠（购自南京青龙山实验动物中心）12只，4只用于预试验确定海藻糖与氯化锌培养液浓度，8只用于正式试验。试验动物饲养于大学动物科技学院试验动物饲养中心，温度25 °C，湿度50% ± 5%，光/暗周期为12 h / 12 h，自由采食和饮水。正式试验前饲养一周观察其健康状况。试验操作按照大学动物护理委员会编写的试验动物护理和使用指南进行。
试验试剂：胶原酶Ⅱ为Sigma公司产品；Dulbeccos Modified eagles MediumHams F12 Medium (DMEMF12 medium)培养基、新生牛血清、青霉素和链霉素为美国Gibco公司产品；微量MDA、MTT试剂盒为南京建成生物工程研究所产品；海藻糖（Dtrehalose，无水）、氯化锌（分析纯）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司。
试验仪器：倒置显微镜、CO2培养箱、外科手术器械等由大学动物科技学院生殖生理实验室提供；分光光度计由大学动物科技学院实验中心提供。
1.2 方法
1.2.1 试验设计
预试验1：选取4只14周龄健康雄性大鼠，处死后提取睾丸间质细胞于96孔板上进行细胞培养（37 oC，5% CO2），24 h后吸出原培养液，加入等体积不同浓度的海藻糖培养液（0, 10, 100, 200, 400 mmol/L），又24 h后进行热应激（39 °C，2 h），检测细胞活力，比对选取效果抗热应激最显著的海藻糖浓度。
预试验2：加入不同浓度的氯化锌培养液（0, 100, 200, 400, 800, 1000 μmol/L），操作同上。
主试验：选取8只14周龄健康雄性大鼠，分为热处理组（T组）与对照组（CT组），每组分为4个处理（100 mmol/L海藻糖组、400 μmol/L氯化锌组、15 μmol/L TPEN组和DMEM组）其余操作同上。
1.2.2 分离提取睾丸间质细胞
（1）处死大鼠
采用颈部脱臼法迅速处死大鼠，转移至无菌操作间内进行手术操作。
（2）无菌采集睾丸
在PBS培养液中去除被膜和血管，打散睾丸实质，放入纯DMEM培养基中。
（3）酶解睾丸间质组织
在培养基中加入I型胶原酶（浓度：10 mg/mL），在34 °C水浴条件下震荡（确保培养液在30 mL以上）。
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