亚精胺通过增加肝脏自噬缓解慢性应激对肝脏损伤的机制研究
慢性应激是导致动物肝脏损伤的重要因素。亚精胺能激活机体自噬功能，清除损坏的细胞器，改善细胞功能。本研究拟通过地塞米松注射模拟小鼠慢性应激，并通过腹腔注射亚精胺探讨其是否通过激活肝脏自噬缓解慢性应激对肝脏的损害。研究结果显示腹腔注射地塞米松和亚精胺都显著降低了小鼠体重。亚精胺注射能导致肝窦内红细胞聚集，极显著升高血清中ALT、AST、LDH的活性，显著增加了BUN的含量，但显著降低了血糖含量。亚精胺注射显著升高了肝脏SAT1的基因和蛋白表达，但只在mRNA水平影响自噬基因的表达。我们的结果表明腹腔注射亚精胺可以增加肝脏自噬但未能缓解慢性应激对肝脏的损伤。
目录
摘要.....1关键词.....1
Abstract...........1
Key words...... 1
引言.........................1
1材料与方法..... ............3
1.1 实验动物与样品采集..............................................3
1.1.1 实验动物与分组...........................3
1.1.2 试验样品采集...........................3
1.2主要试剂与仪器 .....................3
1.3 HE染色.........................4
1.4 血液生化指标的测定..............4
1.5 小鼠肝脏糖脂代谢和自噬相关基因的表达检测..........4
1.6 小鼠肝脏糖脂代谢和肝脏自噬相关蛋白的表达检测......................... 5
1.6.1 肝脏组织总蛋白提取...................6
1.6.2 蛋白质免疫印迹...................................6
2 结果与分析.........................................................6<
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
br /> 2.1 小鼠体重差异的分析结果..........................................................................6
2.2 HE染色观察小鼠肝脏的损伤情况.........................................................................6
2.3 腹腔注射亚精胺对小鼠血液生化指标的影响......................................................7
2.4 小鼠肝脏糖脂代谢以及自噬相关基因的表达检测......................................................8
2.5 小鼠肝脏糖脂代谢以及自噬相关蛋白的表达检测..............................................9
3 讨论..................................................................10
致谢...........12
参考文献.......13 亚精胺通过增加肝脏自噬缓解慢性应激对肝脏损伤的机制研究
动物药学 路佳兴
引言
一般认为，机体早期的应激反应是一种重要的防御性机制，是生理反应的一部分， 但严重的应激反应常能引起炎症介质或细胞因子的过度释放及神经内分泌紊乱，从而造成局部和全身性损害及代谢的改变，尤其是在畜禽养殖方面面临着重大危机。应激状态下产生的炎症介质或细胞因子，比如：肿瘤坏死因子( TNF α )，血小板活化因子( PAF)，白细胞介素1(IL1)，白细胞介素6(IL6)，一氧化氮(NO)，氧自由基( oxygen derived free radicals , OFR)，均会导致动物生产性能低下，免疫抑制以及代谢紊乱。应激状态下神经内分泌系统的改变主要为下丘脑垂体肾上腺皮质轴(HPA)和交感肾上腺髓质轴的强烈兴奋[]。长期应激导致肝脏的损伤，严重者发生慢性病毒性肝炎、肝硬化、肝细胞癌，以及影响肝脏的正常代谢功能。肝脏是糖脂代谢的重要场所，大量的文献表明慢性应激能导致机体高血糖症[]以及脂质积累产生的脂肪肝[]。因此，修复肝损伤所致的肝脏的能量代谢紊乱是缓解慢性应激的关键科学问题。
肝脏是机体最重要的代谢器官，担负着营养物质转化、蛋白质合成、能量生成、清除氧自由基及氧化的蛋白、核酸和损坏的细胞器等方面的作用，对新生弱仔猪显得尤为重要。自噬（Autophagy）是肝脏最重要的生理功能之一，它平衡了机体对能量和营养的需求，清除了错误折叠蛋白，降解了功能受损的亚细胞结构。此过程产生的葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等营养物质再循环供给能量利用，维持机体能量生成。自噬作为真核细胞广泛存在的降解/再循环系统，对细胞新陈代谢具有重要作用[]。在营养充足情况下，机体自噬水平很低；当机体处于饥饿、能量匮乏的情况下，机体自噬会迅速提高。已证明，胰岛素和生长因子抑制自噬发生，能量或氨基酸缺乏、缺氧、应激能因素能促进自噬发生。自噬体（Autophagosome）形成双层膜结构的囊泡过程中，一系列自噬（Autophagy，atg）相关基因产生的蛋白复合物参与其中。Atg1/ULK1复合物是自噬诱导的第一个调节点[]。当营养充足时，mTORC1与ULK1 结合抑制自噬；当饥饿时，ULK1被磷酸化，脱离mTORC1，与Atg13形成复合物，启动自噬的成核与延伸。自噬体的成核通过Atg6聚集3磷酸肌醇3激酶Vps34产生磷酸肌醇3磷酸，与泛素样分子Atg12和LC3形成共轭体使膜进行延伸[]。同时，泛素激活样酶Atg7和泛素结合样酶Atg10共价结合Atg12与Atg5的复合物，再与Atg16L1 结合形成自噬前体[]。紧接着第二次泛素样反应发生，蛋白酶Atg4使LC3蛋白c端22个氨基酸降解产生LC3Ⅱ，在Atg7 和泛素结合样酶 Atg3 作用下，与自噬体膜结合，形成成熟的自噬体[][]。成熟的自噬体被运输到溶酶体，发生融合，将包裹的内容物分解成氨基酸、脂、核酸和碳水化合物释放到胞浆供细胞再利用。
亚精胺由腐胺与脱羧的S腺苷甲硫氨酸反应生成，同时也是精胺的前体，是多胺类物质，广泛存在于日常食物中，柑橘、大豆、茶叶、蘑菇都含有丰富的精胺。最近研究表明[][]，亚精胺通过增强自噬基因的表达缓解细胞氧化应激和坏死，延长酵母、线虫、果蝇和人免疫细胞的寿命。Morselli等人[]发现低剂量的亚精胺能迅速地促进酵母和人肠道癌细胞胞浆内Atg5和LC3蛋白去乙酰化，激活细胞自噬。以上结果表明，亚精胺的去乙酰化作用能作用于胞浆和细胞核。本项目拟以地塞米松注射建立小鼠慢性应激导致肝脏糖代谢紊乱，并通过腹腔注射亚精胺揭示其通过激活肝脏自噬缓解肝脏损伤的机制。
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摘要.....1关键词.....1
Abstract...........1
Key words...... 1
引言.........................1
1材料与方法..... ............3
1.1 实验动物与样品采集..............................................3
1.1.1 实验动物与分组...........................3
1.1.2 试验样品采集...........................3
1.2主要试剂与仪器 .....................3
1.3 HE染色.........................4
1.4 血液生化指标的测定..............4
1.5 小鼠肝脏糖脂代谢和自噬相关基因的表达检测..........4
1.6 小鼠肝脏糖脂代谢和肝脏自噬相关蛋白的表达检测......................... 5
1.6.1 肝脏组织总蛋白提取...................6
1.6.2 蛋白质免疫印迹...................................6
2 结果与分析.........................................................6<
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
br /> 2.1 小鼠体重差异的分析结果..........................................................................6
2.2 HE染色观察小鼠肝脏的损伤情况.........................................................................6
2.3 腹腔注射亚精胺对小鼠血液生化指标的影响......................................................7
2.4 小鼠肝脏糖脂代谢以及自噬相关基因的表达检测......................................................8
2.5 小鼠肝脏糖脂代谢以及自噬相关蛋白的表达检测..............................................9
3 讨论..................................................................10
致谢...........12
参考文献.......13 亚精胺通过增加肝脏自噬缓解慢性应激对肝脏损伤的机制研究
动物药学 路佳兴
引言
一般认为，机体早期的应激反应是一种重要的防御性机制，是生理反应的一部分， 但严重的应激反应常能引起炎症介质或细胞因子的过度释放及神经内分泌紊乱，从而造成局部和全身性损害及代谢的改变，尤其是在畜禽养殖方面面临着重大危机。应激状态下产生的炎症介质或细胞因子，比如：肿瘤坏死因子( TNF α )，血小板活化因子( PAF)，白细胞介素1(IL1)，白细胞介素6(IL6)，一氧化氮(NO)，氧自由基( oxygen derived free radicals , OFR)，均会导致动物生产性能低下，免疫抑制以及代谢紊乱。应激状态下神经内分泌系统的改变主要为下丘脑垂体肾上腺皮质轴(HPA)和交感肾上腺髓质轴的强烈兴奋[]。长期应激导致肝脏的损伤，严重者发生慢性病毒性肝炎、肝硬化、肝细胞癌，以及影响肝脏的正常代谢功能。肝脏是糖脂代谢的重要场所，大量的文献表明慢性应激能导致机体高血糖症[]以及脂质积累产生的脂肪肝[]。因此，修复肝损伤所致的肝脏的能量代谢紊乱是缓解慢性应激的关键科学问题。
肝脏是机体最重要的代谢器官，担负着营养物质转化、蛋白质合成、能量生成、清除氧自由基及氧化的蛋白、核酸和损坏的细胞器等方面的作用，对新生弱仔猪显得尤为重要。自噬（Autophagy）是肝脏最重要的生理功能之一，它平衡了机体对能量和营养的需求，清除了错误折叠蛋白，降解了功能受损的亚细胞结构。此过程产生的葡萄糖、氨基酸、脂肪酸等营养物质再循环供给能量利用，维持机体能量生成。自噬作为真核细胞广泛存在的降解/再循环系统，对细胞新陈代谢具有重要作用[]。在营养充足情况下，机体自噬水平很低；当机体处于饥饿、能量匮乏的情况下，机体自噬会迅速提高。已证明，胰岛素和生长因子抑制自噬发生，能量或氨基酸缺乏、缺氧、应激能因素能促进自噬发生。自噬体（Autophagosome）形成双层膜结构的囊泡过程中，一系列自噬（Autophagy，atg）相关基因产生的蛋白复合物参与其中。Atg1/ULK1复合物是自噬诱导的第一个调节点[]。当营养充足时，mTORC1与ULK1 结合抑制自噬；当饥饿时，ULK1被磷酸化，脱离mTORC1，与Atg13形成复合物，启动自噬的成核与延伸。自噬体的成核通过Atg6聚集3磷酸肌醇3激酶Vps34产生磷酸肌醇3磷酸，与泛素样分子Atg12和LC3形成共轭体使膜进行延伸[]。同时，泛素激活样酶Atg7和泛素结合样酶Atg10共价结合Atg12与Atg5的复合物，再与Atg16L1 结合形成自噬前体[]。紧接着第二次泛素样反应发生，蛋白酶Atg4使LC3蛋白c端22个氨基酸降解产生LC3Ⅱ，在Atg7 和泛素结合样酶 Atg3 作用下，与自噬体膜结合，形成成熟的自噬体[][]。成熟的自噬体被运输到溶酶体，发生融合，将包裹的内容物分解成氨基酸、脂、核酸和碳水化合物释放到胞浆供细胞再利用。
亚精胺由腐胺与脱羧的S腺苷甲硫氨酸反应生成，同时也是精胺的前体，是多胺类物质，广泛存在于日常食物中，柑橘、大豆、茶叶、蘑菇都含有丰富的精胺。最近研究表明[][]，亚精胺通过增强自噬基因的表达缓解细胞氧化应激和坏死，延长酵母、线虫、果蝇和人免疫细胞的寿命。Morselli等人[]发现低剂量的亚精胺能迅速地促进酵母和人肠道癌细胞胞浆内Atg5和LC3蛋白去乙酰化，激活细胞自噬。以上结果表明，亚精胺的去乙酰化作用能作用于胞浆和细胞核。本项目拟以地塞米松注射建立小鼠慢性应激导致肝脏糖代谢紊乱，并通过腹腔注射亚精胺揭示其通过激活肝脏自噬缓解肝脏损伤的机制。
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