淫羊藿多糖磷酸化修饰的单因素实验研究
利用混合磷酸盐法修饰法进行淫羊藿多糖的磷酸化研究，筛选其磷酸化修饰的单因素修饰条件。用水提醇沉法提取淫羊藿粗多糖，采用混合磷酸盐法，以磷酸化淫羊藿粗多糖的磷酸根接枝量为检测指标，通过单因素试验考验反应温度、反应时间、反应pH值、磷酸化试剂质量浓度对磷酸化多糖磷酸化修饰结果的影响，优选工艺条件，确定当反应温度为90℃，反应时间为3h，反应pH为9时，质量分数为5%三聚磷酸钠和2%三偏磷酸钠时，获得淫羊藿多糖磷酸化修饰的最佳工艺条件。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料与试剂 2
1.2 仪器与设备 2
1.3方法2
1.3.1 淫羊藿多糖的提取与分离纯化2
1.3.2 淫羊藿多糖的磷酸化2
1.3.3 磷酸根含量测定（采用钼蓝比色法）2
1.3.4单因素试验 3
2 结果与分析4
2.1 标准曲线方程的建立4
2.2单因素试验4
2.2.1磷酸化试剂质量浓度对淫羊藿多糖磷酸化修饰的影响4
2.2.2 反应温度对淫羊藿多糖磷酸化修饰的影响4
2.2.3反应时间对淫羊藿多糖磷酸化修饰的影响5
2.2.4反应pH值对淫羊藿多糖磷酸化修饰的影响5
3 讨论6
致谢6
参考文献7
淫羊藿多糖磷酸化修饰的单因素实验研究
引言
淫羊藿又名仙灵脾，为我国传统补益中药，《本草纲目》记载其茎、叶入药，辛温无毒，有坚筋骨、益精气、补腰膝、强心力等作用[1]。在东亚地区，淫羊藿也被作为民族药物[2,3]。药理研究表明，淫羊藿对心脑血管系统、血液系统、免疫系统、生殖系统、骨髓系统等有一定的保健作用[4]，具有调节雄性发育、调节免疫、抑制肿瘤、改善心血管系统功能、缓解妇女更年期症状、调节内分泌、抗骨质疏松、抗肝毒素、抗氧化、抗衰老等多种生理活性[58]。淫羊藿主要成分是黄酮类和多糖，此外还含有生物碱、木脂素类等营养成分或生物活性成分[9 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
]，其中淫羊藿多糖具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、调节免疫、延缓衰老等多种活性[8,1011] 。
研究表明，多糖及其衍生物具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤等活性，多糖的硫酸化、磷酸化和硒化衍生物的其生物活性较原多糖均有显著提高[1214]。目前对多糖磷酸化的研究相对较少，对其活性研究主要集中在免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等方面，而对淫羊藿多糖的磷酸化方法研究较少。
基于上述原因，本课题以课题组前期研究较多的淫羊藿多糖为研究对象，采用单因素筛选优化淫羊藿多糖磷酸化方法，以期获得磷酸化淫羊藿多糖的最佳制备工艺，为进一步研究磷酸化淫羊藿多糖提供基础。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
淫羊藿药材，购自南京天元药店，批号20141001。三偏磷酸钠，阿拉丁试剂有限公司，批号L1226014；多聚磷酸钠，国药集团化学试剂有限公司，批号20041228；磷酸二氢钾，南京化学试剂有限公司，批号10031620135；TRIS，Beijing Solarbio Science & Technology Co.， Ltd；浓硫酸，上海凌峰化学试剂有限公司，批号20111025；浓盐酸，南京化学试剂有限公司，批号11011130017；钼酸铵，广东光华科技股份有限公司，批号20120926；抗坏血酸，Solarbio公司，批号914A033；氯化镁，汕头市西拢化工厂有限公司，批号0902181；氢氧化钠，西拢化工股份有限公司，批号1304282。
1.2 仪器与设备
754型紫外可见光分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；FA1104N型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；SHZC型水浴恒温振荡器，上海浦东物理光学仪器厂；Scientz12N型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 淫羊藿多糖的提取与分离纯化
采用水提醇沉法提取淫羊藿多糖，方法如下：取1Kg的干燥药材，加入水20L左右，煮沸1.5h，用4层纱布过滤得提取液，浓缩至1L，离心去除杂质。加95%乙醇至80%比例，静置过夜，4000rpm离心15min，所得沉淀经冷冻干燥得干品约96.90g，淫羊藿粗多糖的得率为9.6%。具体操作流程如图1。
图1 淫羊藿多糖的提取流程图
1.3.2 淫羊藿多糖的磷酸化
小烧杯中用水溶解一定量的磷酸化试剂，加入等量5%硫酸钠溶液下，再加入精制的10mg/mL淫羊藿粗多糖，调pH值后（用1%NaOH溶液或1%HCl溶液），在一定温度条件下反应一定时间，反应后溶液于透析袋内选用截留相对分子质量为3500的透析袋以去离子水为透析液透析，72h后停止透析。将透析袋内液体浓缩到适量体积后进行冷冻干燥得磷酸化衍生物。
1.3.3 磷酸根含量测定（钼蓝比色法）
1.3.3.1 试剂的配置：
Tris缓冲溶液的配制：准确称取3.6g三羟甲基氨基甲烷和120mgMgCl2 ?6H2O溶解于蒸馏水中，并用水稀释至300ml，最后用1mol/L HCl调节pH至7。
定磷试剂的配制：分别取等体积的质量分数为20%的抗坏血酸（Vc）水溶液、3mol/L的H2SO4溶液、3%钼酸铵溶液混合物。
磷酸盐标准溶液的配制：精密称取0.7165g干燥至恒重的磷酸二氢钾溶解于去离子水中，将其移入1000ml容量瓶，加去离子水定容至刻度，摇匀。吸取1mL该溶液，用去离子水定溶于50mL容量瓶中摇匀备用。此溶液相当于0.01mg/mL磷酸盐。
1.3.3.2 标准曲线的绘制：
准确吸取磷酸根标准溶液0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL，分别移入25mL比色管中，各管加去离子水至总体积5mL，加入Tris缓冲液3mL，摇匀后加入3mL定磷试剂，在45℃恒温水浴锅中加热30min，取出后在580nm处测定吸光度，以磷酸根浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。
1.3.3.3 样品磷酸根含量的测定：
准确称取样品25mg，用电炉进行灰化，将剩余残渣用0.5mL的HCl溶液（1：1，v/v）溶解后用去离子水将其移入25mL容量瓶中定容，测定时吸取此溶液1.25mL，移入25mL容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，摇匀备用。测定时 吸取灰化溶液1mL置于25mL比色管中，加去离子水至总体积5mL，然后按绘制标准曲线的操作方法测得吸光度，带入回归方程得磷酸根含量。
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料与试剂 2
1.2 仪器与设备 2
1.3方法2
1.3.1 淫羊藿多糖的提取与分离纯化2
1.3.2 淫羊藿多糖的磷酸化2
1.3.3 磷酸根含量测定（采用钼蓝比色法）2
1.3.4单因素试验 3
2 结果与分析4
2.1 标准曲线方程的建立4
2.2单因素试验4
2.2.1磷酸化试剂质量浓度对淫羊藿多糖磷酸化修饰的影响4
2.2.2 反应温度对淫羊藿多糖磷酸化修饰的影响4
2.2.3反应时间对淫羊藿多糖磷酸化修饰的影响5
2.2.4反应pH值对淫羊藿多糖磷酸化修饰的影响5
3 讨论6
致谢6
参考文献7
淫羊藿多糖磷酸化修饰的单因素实验研究
引言
淫羊藿又名仙灵脾，为我国传统补益中药，《本草纲目》记载其茎、叶入药，辛温无毒，有坚筋骨、益精气、补腰膝、强心力等作用[1]。在东亚地区，淫羊藿也被作为民族药物[2,3]。药理研究表明，淫羊藿对心脑血管系统、血液系统、免疫系统、生殖系统、骨髓系统等有一定的保健作用[4]，具有调节雄性发育、调节免疫、抑制肿瘤、改善心血管系统功能、缓解妇女更年期症状、调节内分泌、抗骨质疏松、抗肝毒素、抗氧化、抗衰老等多种生理活性[58]。淫羊藿主要成分是黄酮类和多糖，此外还含有生物碱、木脂素类等营养成分或生物活性成分[9 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
]，其中淫羊藿多糖具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、调节免疫、延缓衰老等多种活性[8,1011] 。
研究表明，多糖及其衍生物具有免疫调节、抗病毒、抗肿瘤等活性，多糖的硫酸化、磷酸化和硒化衍生物的其生物活性较原多糖均有显著提高[1214]。目前对多糖磷酸化的研究相对较少，对其活性研究主要集中在免疫调节、抗肿瘤、抗病毒等方面，而对淫羊藿多糖的磷酸化方法研究较少。
基于上述原因，本课题以课题组前期研究较多的淫羊藿多糖为研究对象，采用单因素筛选优化淫羊藿多糖磷酸化方法，以期获得磷酸化淫羊藿多糖的最佳制备工艺，为进一步研究磷酸化淫羊藿多糖提供基础。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
淫羊藿药材，购自南京天元药店，批号20141001。三偏磷酸钠，阿拉丁试剂有限公司，批号L1226014；多聚磷酸钠，国药集团化学试剂有限公司，批号20041228；磷酸二氢钾，南京化学试剂有限公司，批号10031620135；TRIS，Beijing Solarbio Science & Technology Co.， Ltd；浓硫酸，上海凌峰化学试剂有限公司，批号20111025；浓盐酸，南京化学试剂有限公司，批号11011130017；钼酸铵，广东光华科技股份有限公司，批号20120926；抗坏血酸，Solarbio公司，批号914A033；氯化镁，汕头市西拢化工厂有限公司，批号0902181；氢氧化钠，西拢化工股份有限公司，批号1304282。
1.2 仪器与设备
754型紫外可见光分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；FA1104N型电子天平，上海精密科学仪器有限公司；SHZC型水浴恒温振荡器，上海浦东物理光学仪器厂；Scientz12N型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.3 方法
1.3.1 淫羊藿多糖的提取与分离纯化
采用水提醇沉法提取淫羊藿多糖，方法如下：取1Kg的干燥药材，加入水20L左右，煮沸1.5h，用4层纱布过滤得提取液，浓缩至1L，离心去除杂质。加95%乙醇至80%比例，静置过夜，4000rpm离心15min，所得沉淀经冷冻干燥得干品约96.90g，淫羊藿粗多糖的得率为9.6%。具体操作流程如图1。
图1 淫羊藿多糖的提取流程图
1.3.2 淫羊藿多糖的磷酸化
小烧杯中用水溶解一定量的磷酸化试剂，加入等量5%硫酸钠溶液下，再加入精制的10mg/mL淫羊藿粗多糖，调pH值后（用1%NaOH溶液或1%HCl溶液），在一定温度条件下反应一定时间，反应后溶液于透析袋内选用截留相对分子质量为3500的透析袋以去离子水为透析液透析，72h后停止透析。将透析袋内液体浓缩到适量体积后进行冷冻干燥得磷酸化衍生物。
1.3.3 磷酸根含量测定（钼蓝比色法）
1.3.3.1 试剂的配置：
Tris缓冲溶液的配制：准确称取3.6g三羟甲基氨基甲烷和120mgMgCl2 ?6H2O溶解于蒸馏水中，并用水稀释至300ml，最后用1mol/L HCl调节pH至7。
定磷试剂的配制：分别取等体积的质量分数为20%的抗坏血酸（Vc）水溶液、3mol/L的H2SO4溶液、3%钼酸铵溶液混合物。
磷酸盐标准溶液的配制：精密称取0.7165g干燥至恒重的磷酸二氢钾溶解于去离子水中，将其移入1000ml容量瓶，加去离子水定容至刻度，摇匀。吸取1mL该溶液，用去离子水定溶于50mL容量瓶中摇匀备用。此溶液相当于0.01mg/mL磷酸盐。
1.3.3.2 标准曲线的绘制：
准确吸取磷酸根标准溶液0.0mL、1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL、5.0mL，分别移入25mL比色管中，各管加去离子水至总体积5mL，加入Tris缓冲液3mL，摇匀后加入3mL定磷试剂，在45℃恒温水浴锅中加热30min，取出后在580nm处测定吸光度，以磷酸根浓度为横坐标（X），吸光度为纵坐标（Y），绘制标准曲线。
1.3.3.3 样品磷酸根含量的测定：
准确称取样品25mg，用电炉进行灰化，将剩余残渣用0.5mL的HCl溶液（1：1，v/v）溶解后用去离子水将其移入25mL容量瓶中定容，测定时吸取此溶液1.25mL，移入25mL容量瓶中，用去离子水稀释至刻度，摇匀备用。测定时 吸取灰化溶液1mL置于25mL比色管中，加去离子水至总体积5mL，然后按绘制标准曲线的操作方法测得吸光度，带入回归方程得磷酸根含量。
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