不同发育阶段生殖细胞中cd9表达的检测与分析
CD9 是介导精卵质膜融合的一种重要的蛋白分子，在精卵结合中发挥重要作用，是大鼠和小鼠精原干细胞的表面标志物，此外还可作为连接蛋白参与细胞的黏附、运动和信号转导，具有较为复杂的生物学功能。本课题通过免疫组化和RT-PCR检测5日龄、20日龄及42日龄小鼠卵巢和睾丸中CD9的表达情况，从而分析CD9在不同阶段小鼠的生殖细胞中的表达量及生物学意义。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1免疫组化2
1.2.2 RTPCR3
2 结果及分析5
2.1免疫组化结果5
2.2 RTPCR结果7
3讨论 8
致谢8
参考文献8
不同发育阶段生殖细胞中CD9表达的检测和分析
引言
CD9 是四次跨膜蛋白家族中介导精卵质膜融合的一个成员，它是一个2426 kDa的细胞膜糖蛋白，该蛋白分子含有4个疏水区，往返4次穿过细胞膜[1]。CD9有一个细胞外小环(EC1)，细胞外大环(EC2)，第二个环大于第一个环并且有着高度保留的氨基酸残基[2]。CD9蛋白在人组织细胞中分布较为广泛，主要分布在前B 细胞、血小板、单核细胞等造血细胞，以及骨髓细胞、肌肉细胞和脑细胞中，另外CD9还普遍在不同组织的干细胞表面表达，在卵母细胞中CD9分布于整个卵母细胞膜，以及除去有丝分裂纺锤体的其他地方[3]。
CD9是有一些不同的多蛋白复合体组成并参与不同细胞的形成和生理过程，它有多种生物学功能，如维系细胞黏着[4]、信号传导[6]、调节细胞运动和生长[5] [12]、细胞癌变[8]、免疫调节[7]等，但对其作用机制仍不清楚。同时，在精卵结合中也发挥重要作用，是大鼠和小鼠精原干细胞的表面标志物。
CD9 虽然广泛表达于各种组织中，但在生殖细胞中表达与定位的深入研究很少，目前只有在 SD（Spraguedawley）大鼠的精原干细胞[9]、猪卵巢[10]，以及小鼠精巢和精子及卵子上分布的报道[11]，而在关于CD9在不同发 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
育阶段小鼠的生殖细胞中的具体表达量还不清楚。
本课题通过免疫组化检测5日龄、20日龄及42日龄小鼠卵巢和睾丸中CD9的表达情况，并通过RTPCR检测CD9在不同阶段小鼠的生殖细胞中的表达量差异，从而分析CD9在小鼠整个发育过程中的变化趋势及生物学意义。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 主要仪器和器械 德国Eppendorf公司的基因扩增仪；北京六一仪器厂的电泳仪；上海天能科技有限公司的Tanon1600型凝胶成像仪；上海精宏实验设备有限公司的电热恒温水槽；上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂的显微手术器械包；北京六一仪器厂的水平摇床；浙江华海科教仪器厂的HHQ系列的轮转式切片机；上海精宏实验设备有限公司的电热恒温干燥箱；德国Eppendorf公司的微量加样器等。（小四宋体）
1．1．2 主要试剂 天根生物科技有限公司的FastQuant cDNA第一链合成试剂盒；天根生物科技有限公司的TRNzol总RNA提取试剂；其他常规生化试剂均为国产AR级。
1．1．3 实验动物
出生后5日龄、20日龄、42日龄的雄性小鼠和雌性昆明小鼠，均购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场。
1．2 实验方法
1．2.1 免疫组织化学检测CD9的表达
（1）动物处理及标本制作
a．出生后5日龄、20日龄、42日龄雄性和雌性小鼠各3只，称重后脱颈处死；
b．无菌条件下，用酒精棉球擦拭小鼠腹部，然后正中切口 1 次剪开腹部皮肤，沿着腹
线开腹，暴露膀胱，切勿损伤周围肠管、血管组织；
c．准确找到并取出小鼠的睾丸和卵巢，按后续实验需要做不同处理。
（2）组织处理
a．组织固定：取不同日龄小鼠睾丸和卵巢，放入包埋盒中，浸泡于4％的多聚甲醛中
固定，并放置水平摇床上过夜。
b．组织脱水、透明、浸蜡及包埋：把固定过的组织依次放入50％、70％、95％、100％
Ⅰ、100％Ⅱ、100％Ⅲ的ETOH中，每次45min；接着依次放入透明剂Ⅰ、透明剂
Ⅱ、透明剂Ⅲ，每次45min；再依次放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ，每次1hour；通过上述步
骤处理的组织进行包埋。
（3）石蜡切片制作
a．切片刀正确装入持刀夹里，调整切片刀的倾斜度，旋紧刀夹；
b．将冷冻好的组织蜡块置于持蜡台上，调整位置使蜡块接近刀刃，蜡块平面与刀刃形
成一定角度，固定蜡块，并修修整蜡块切面，即可切片；
c．切片厚度为5μm，连续切片3至4次；
d．用牙签托住并取下组织块，放入提前预热至37℃的温水中伸展贴附，3min后捞片,
捞片时玻片要垂直，使切片与玻片间无气泡或多余水分；
e．捞起后晾干，备用。
免疫组化染色
a．选择组织形态完整的玻片，60℃烤片45分钟；
二甲苯脱蜡2次，每次20分钟；
c．复水过程：
100%乙醇2次，每次5分钟，
90%乙醇 5分钟，
80%乙醇 5分钟，
50%乙醇 5分钟，
PBS 10分钟；
胰酶修复：
①0.05%胰酶处理，37℃湿盒12min；
②PBS水平摇床上洗3遍，5min/次。
e．甲醇/H2O2(每200ml 甲醇中加入2ml 30%H2O2，可重复使用) ，室温放置15分钟；
f．PBS洗3次，每次5分钟（水平摇床）；
g．油笔圈好组织；
h．封闭：加上10%山羊血清，完全覆盖住组织，37℃，10min；
i．加入含1%山羊血清的一抗，放入湿盒中，4度过夜，或37度1h；
j．PBS洗3次，每次10分钟（水平摇床）；
k．加入含1%山羊血清的二抗(1:500)，放入湿盒中，室温1小时；
l．PBS洗3次，每次10分钟（水平摇床）；
m．加入含1%山羊血清的streptividinHRP(1:500)，于湿盒中室温放置20分钟；
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1免疫组化2
1.2.2 RTPCR3
2 结果及分析5
2.1免疫组化结果5
2.2 RTPCR结果7
3讨论 8
致谢8
参考文献8
不同发育阶段生殖细胞中CD9表达的检测和分析
引言
CD9 是四次跨膜蛋白家族中介导精卵质膜融合的一个成员，它是一个2426 kDa的细胞膜糖蛋白，该蛋白分子含有4个疏水区，往返4次穿过细胞膜[1]。CD9有一个细胞外小环(EC1)，细胞外大环(EC2)，第二个环大于第一个环并且有着高度保留的氨基酸残基[2]。CD9蛋白在人组织细胞中分布较为广泛，主要分布在前B 细胞、血小板、单核细胞等造血细胞，以及骨髓细胞、肌肉细胞和脑细胞中，另外CD9还普遍在不同组织的干细胞表面表达，在卵母细胞中CD9分布于整个卵母细胞膜，以及除去有丝分裂纺锤体的其他地方[3]。
CD9是有一些不同的多蛋白复合体组成并参与不同细胞的形成和生理过程，它有多种生物学功能，如维系细胞黏着[4]、信号传导[6]、调节细胞运动和生长[5] [12]、细胞癌变[8]、免疫调节[7]等，但对其作用机制仍不清楚。同时，在精卵结合中也发挥重要作用，是大鼠和小鼠精原干细胞的表面标志物。
CD9 虽然广泛表达于各种组织中，但在生殖细胞中表达与定位的深入研究很少，目前只有在 SD（Spraguedawley）大鼠的精原干细胞[9]、猪卵巢[10]，以及小鼠精巢和精子及卵子上分布的报道[11]，而在关于CD9在不同发 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
育阶段小鼠的生殖细胞中的具体表达量还不清楚。
本课题通过免疫组化检测5日龄、20日龄及42日龄小鼠卵巢和睾丸中CD9的表达情况，并通过RTPCR检测CD9在不同阶段小鼠的生殖细胞中的表达量差异，从而分析CD9在小鼠整个发育过程中的变化趋势及生物学意义。
1 材料与方法
1．1 实验材料
1．1．1 主要仪器和器械 德国Eppendorf公司的基因扩增仪；北京六一仪器厂的电泳仪；上海天能科技有限公司的Tanon1600型凝胶成像仪；上海精宏实验设备有限公司的电热恒温水槽；上海医疗器械(集团)有限公司手术器械厂的显微手术器械包；北京六一仪器厂的水平摇床；浙江华海科教仪器厂的HHQ系列的轮转式切片机；上海精宏实验设备有限公司的电热恒温干燥箱；德国Eppendorf公司的微量加样器等。（小四宋体）
1．1．2 主要试剂 天根生物科技有限公司的FastQuant cDNA第一链合成试剂盒；天根生物科技有限公司的TRNzol总RNA提取试剂；其他常规生化试剂均为国产AR级。
1．1．3 实验动物
出生后5日龄、20日龄、42日龄的雄性小鼠和雌性昆明小鼠，均购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场。
1．2 实验方法
1．2.1 免疫组织化学检测CD9的表达
（1）动物处理及标本制作
a．出生后5日龄、20日龄、42日龄雄性和雌性小鼠各3只，称重后脱颈处死；
b．无菌条件下，用酒精棉球擦拭小鼠腹部，然后正中切口 1 次剪开腹部皮肤，沿着腹
线开腹，暴露膀胱，切勿损伤周围肠管、血管组织；
c．准确找到并取出小鼠的睾丸和卵巢，按后续实验需要做不同处理。
（2）组织处理
a．组织固定：取不同日龄小鼠睾丸和卵巢，放入包埋盒中，浸泡于4％的多聚甲醛中
固定，并放置水平摇床上过夜。
b．组织脱水、透明、浸蜡及包埋：把固定过的组织依次放入50％、70％、95％、100％
Ⅰ、100％Ⅱ、100％Ⅲ的ETOH中，每次45min；接着依次放入透明剂Ⅰ、透明剂
Ⅱ、透明剂Ⅲ，每次45min；再依次放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ，每次1hour；通过上述步
骤处理的组织进行包埋。
（3）石蜡切片制作
a．切片刀正确装入持刀夹里，调整切片刀的倾斜度，旋紧刀夹；
b．将冷冻好的组织蜡块置于持蜡台上，调整位置使蜡块接近刀刃，蜡块平面与刀刃形
成一定角度，固定蜡块，并修修整蜡块切面，即可切片；
c．切片厚度为5μm，连续切片3至4次；
d．用牙签托住并取下组织块，放入提前预热至37℃的温水中伸展贴附，3min后捞片,
捞片时玻片要垂直，使切片与玻片间无气泡或多余水分；
e．捞起后晾干，备用。
免疫组化染色
a．选择组织形态完整的玻片，60℃烤片45分钟；
二甲苯脱蜡2次，每次20分钟；
c．复水过程：
100%乙醇2次，每次5分钟，
90%乙醇 5分钟，
80%乙醇 5分钟，
50%乙醇 5分钟，
PBS 10分钟；
胰酶修复：
①0.05%胰酶处理，37℃湿盒12min；
②PBS水平摇床上洗3遍，5min/次。
e．甲醇/H2O2(每200ml 甲醇中加入2ml 30%H2O2，可重复使用) ，室温放置15分钟；
f．PBS洗3次，每次5分钟（水平摇床）；
g．油笔圈好组织；
h．封闭：加上10%山羊血清，完全覆盖住组织，37℃，10min；
i．加入含1%山羊血清的一抗，放入湿盒中，4度过夜，或37度1h；
j．PBS洗3次，每次10分钟（水平摇床）；
k．加入含1%山羊血清的二抗(1:500)，放入湿盒中，室温1小时；
l．PBS洗3次，每次10分钟（水平摇床）；
m．加入含1%山羊血清的streptividinHRP(1:500)，于湿盒中室温放置20分钟；
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