乳酸杆菌S层蛋白对猪流行性腹泻病毒黏附和入侵Vero细胞的拮抗作用
乳酸杆菌S层蛋白对猪流行性腹泻病毒黏附和入侵Vero细胞的拮抗作用[20200507184427]
摘要：【目的】研究乳酸杆菌中S-层蛋白（S-layer protein）是否能够拮抗猪流行性腹泻病毒（PEDV）黏附及入侵Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）。【方法】首先提取并纯化乳酸杆菌的S-层蛋白；然后通过竞争黏附试验与排斥黏附试验，观察S-层蛋白对PEDV黏附和入侵Vero细胞的拮抗作用。【结果】竞争试验中S-层蛋白对PEDV的黏附入侵存在一定的拮抗作用；在排斥试验中发现，S-蛋白则能显著地抑制PEDV的黏附及入侵。【结论】乳酸杆菌S-层蛋白对PEDV可产生显著的拮抗作用，在排斥黏附试验中效果明显，这可能与S-层蛋白在Vero细胞表面的自我组装有关。
关键词 ：乳酸杆菌；S-层蛋白；PEDV；Vero细胞
The antagonism of the S-layer protein of lactic acid bacillus to the adhesion and invasion to VERO cell by PEDV
Student majoring in veterinary medicine WangXiaodong
Tutor Yang Qian
Abstract： [Objective] Lactobacillus S-layer protein is able to antagonize the porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) adhesion and invasion of Vero cells (African green monkey kidney cells). [Method] First extracted and purified Lactobacillus S-layer protein; then adhesion test adhesion test and exclusion through competition, antagonism was observed S-layer protein of PEDV adhesion and invasion of Vero cells. [Results] S-layer protein of competition test adhesion invasion of PEDV there is a certain antagonism; found in the exclusion test, S-protein could significantly inhibit the adhesion and invasion of PEDV. [Conclusion] Lactobacillus S-layer protein on PEDV can produce significant antagonism, adhesion test results in the exclusion of obvious, which may be S-layer protein in Vero cell surface self-assembly related.
Key Words： lactic acid bacillus；S-layer protein；PEDV；Vero cell
PEDV(猪流行腹泻病毒),属于冠状病毒科，冠状病毒属。该病毒经口和鼻感染后，直接进入小肠，存在于肠绒毛上皮细胞和肠系膜淋巴结，病毒的复制是在小肠和结肠绒毛上皮细胞浆中进行，是引起腹泻的主要原因。如果能阻止该病毒在肠上皮细胞表面的黏附定植，将有效地阻止PEDV对宿主的感染[1-2]。
乳酸杆菌是人类和动物肠道中一种正常的优势有益菌，具有重要的生理作用，可以调节肠道菌群，改善肠道微环境，提高机体免疫力等作用。此外乳酸杆菌还具有拮抗多种病原菌的作用，比如肠炎沙门氏菌，链球菌等[3-5]。乳酸杆菌外包裹一层呈晶格状排列结构的S-层蛋白（S-layer protein）。研究显示，乳酸杆菌拮抗病原菌的作用与S-层蛋白密切相关[6]。近来有学者报道，乳酸杆菌S-层蛋白可拮抗胡宁病毒（Junin virus，JUNV）的黏附及入侵。那么S-层蛋白是否对PEDV存在拮抗作用，国内外未见报道。
本研究首先提纯了乳酸杆菌的S-层蛋白，然后以Vero 细胞作为细胞模型，研究了S-层蛋白对PEDV黏附入侵的抑制。首先，进行VERO细胞的培养、传代以及乳酸杆菌的培养与收集；其次，对乳酸杆菌的S-层蛋白进行提纯、透析及其重悬；通过对VERO细胞进行接毒和添加S-层蛋白，摸索作用时间和添加S-蛋白的剂量，找到最佳的作用时间和蛋白剂量；最后通过细胞病变来评价S-层蛋白对PEDV黏附和入侵Vero细胞的拮抗作用。
1 实验器材和方法
1.1 材料：
1.1.1 菌株：
猪小肠分离的乳酸杆菌96株( 仅鉴定到乳酸杆菌属水平); PEDV(猪流行腹泻病毒)；以上均由江苏省农科院国家兽用生物制品工程技术研究中心猪病二组实验室提供；嗜乳酸杆菌ATCC4356(Lactobacillus acidophilus)，购自微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
1.1.2 仪器和试剂：
Tris HCl；NaCl；GSH(还原性)；GSSH(氧化性)；L精氨酸；VERO细胞株; 高糖DMEM 培养基(Gibco)； MRS肉汤；蒸馏水；洗脱柱；0.5mol/mL的NaCl溶液；96孔细胞培养板；琼脂糖凝胶电泳与SDS-PAGE凝胶电泳Marker与buffer；台式离心机；细胞培养瓶；超净台等；以上仪器与试剂均江苏省农科院提供；胰蛋白酶(Gibco)购自美国英骏公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。
1.2 乳酸杆菌的培养及乳酸杆菌S-层蛋白的提纯
1.2.1 乳酸杆菌的培养
首先配置MRS肉汤，剂量为1L。成分为:
蛋白陈????? 10.0g
牛肉粉????? 5.0g
酵母粉????? 4.0g
葡萄糖????? ?20.0g
吐温80? 1.0mL
磷酸氢二钾?? 2.0g
乙酸钠?????? 5.0g
柠檬酸三铵?? 2.0g
硫酸镁????? ?0.2g
硫酸锰?????? 0.05g
琼脂粉?????? 15.0g
蒸馏水?????? 1000mL?
将上述成分加人蒸馏水中,加热溶解,校正pH为6.2，装至1L培养瓶中，在 121℃下高压灭菌15min-20min。抽取7-8mL菌液到1L的MRS肉汤瓶中，37℃温箱培养过夜。由于乳酸杆菌为厌氧菌，培养时做好密封。
1.2.2乳酸杆菌S-层蛋白的提纯?
首先，对已经培养好的乳酸杆菌进行初步离心弃上清；用预冷的蒸馏水对沉淀进行重悬；再次离心（5000r，10min，4℃）弃上清；用10mL4M盐酸胍对沉淀进行重悬；对其进行摇床孵化（200r，37℃，1h）；再对其离心（13000r，15min，4℃），收集上清；对上清分别用4M、3M、2M、1M和0M盐酸胍进行透析。
其次，对乳酸杆菌S-层蛋白进行粗提，并将其粗提产物冻干，－20℃保存备用。
最后，对乳酸杆菌S-层蛋白进行纯化，本试验选取阴离子交换柱DE 52，常规装柱，0. 05 mol /L PB 缓冲液( pH 8. 0 )进行平衡;将粗提S-层蛋白冻干样品用上述缓冲液重悬过柱，收集蛋白洗脱峰;为减少蛋白损失，随即用0. 5 mol /L 的NaCl 洗脱，收集蛋白洗脱峰;用SDS-PAGE 分析验证提纯效果，S-层蛋白的终浓度为100mg/L。
1.3 细胞培养和试验设计
弃掉原细胞培养瓶中的旧细胞培养液，取10%DMEM培养液，抽取10mL加入细胞培养瓶中，并在细胞培养瓶中加入胎牛血清和双抗(链霉素、青霉素浓度均为100 U /mL) ，每隔48小时对其进行传代。接毒试验前一天将Vero细胞添加到96 孔培养板，细胞长成单层后使用。
在96孔板上Vero细胞长成单层后，弃掉旧培养液，于每孔分别加入100uL2%DMEM维持液。添加到细胞板的S-蛋白（终浓度100mg/L）梯度依次为15uL、30uL、45uL和60uL。并将96孔细胞板规划为6部分，分别做：病毒对照和空白对照、S-层蛋白对Vero细胞生长的影响、S-层蛋白对PEDV的活性影响、竞争黏附试验、排斥黏附试验。在每项试验做完后，将Vero细胞培养板放入温箱（37℃，5%CO2)进行培养，并在此后的1-3内天对Vero细胞进行观察并拍照分析。
1.4 乳酸杆菌S-层蛋白对PEDV黏附和入侵VERO细胞的竞争黏附试验
将S-层蛋白和PEDV同时加入到Vero细胞培养板，蛋白（终浓度100mg/L）梯度分别是上述梯度，每个处理设3个重复孔，病毒剂量都为200TCID50/ml。
1.5 乳酸杆菌S-层蛋白对PEDV黏附和入侵VERO细胞的排斥黏附试验
按上述蛋白（终浓度100mg/L）梯度，先将S-层蛋白依梯度添加到Vero细胞培养板中，每个处理设3个重复孔，放入温箱（37℃，5%CO2)中作用1小时，然后在Vero细胞培养板中添加PEDV各200TCID50/100uL。
2 结果
图1
病毒对照
在添加PEDV后，从图1可以看出，细胞病变特征为：细胞肿胀变圆，遮光性增强，颗粒物质增多，细胞大量脱落崩解，细胞间隙变大，细胞拉成网状。
图2
空白对照
在空白对照中（如图18所示）：Vero细胞生长良好，细胞膜界限清晰，胞浆透明度好，细胞形态完整。
2.1 S-层蛋白对Vero细胞生长的影响
将S-层蛋白按照上述蛋白（终浓度100mg/L）梯度添加到Vero细胞培养板中，每个处理设3个重复孔，再于Vero细胞培养板中加入2%DMEM维持液各100uL；意在验证S-层蛋白是否会对Vero细胞的生长产生影响。
图3
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为15uL
图4
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为30uL
图5
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为45uL
图6
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为60 uL
由以上观察得出（如图3、4、5和6所示）：Vero细胞生长状况良好，可以清晰的看到细胞膜之间的间隙，细胞有着完整的形态，胞浆透明度良好。这说明，在Vero细胞生长时添加S-层蛋白是对Vero细胞的生长无任何明显影响的。
2.2 S-层蛋白对PEDV的活性的影响
将S-层蛋白和PEDV首先在温箱（37℃，5%CO2)作用1小时，蛋白（终浓度100mg/L）梯度分别是上述梯度，每个处理设3个重复孔，病毒剂量都为200TCID50/ml。作用后将其加入Vero细胞培养板。
图7
S-层蛋白（终浓度100mg/L）剂量为15uL
图8
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为30uL
图9
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为45uL
图10
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为60uL
如图7-10所示：预先将不同剂量的S-层蛋白与PEDV作用后，PEDV在Vero细胞上引起的感染病变无明显差异，表明S-层蛋白对PEDV的活性没有明显影响。
2.3 S-层蛋白对PEDV黏附和入侵VERO细胞的竞争黏附的影响
图11
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为15uL
在图11中：部分细胞肿胀变圆，遮光性增强，某些区域颗粒物质增多，细胞间隙变大，细胞拉成网状。
图12
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为30uL
在图12中：在部分区域遮光性增强，少量细胞拉成网状。
图13
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为45uL
图14
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为60uL
在图13和14中：在部分区域可见颗粒物质增多，少量细胞呈梭形，胞浆透明度良好，细胞形态完整，细胞膜界限清晰，细胞形态基本完整。
由以上观察分析得出：在图11中能看到Vero细胞有明显的病变，图12-14细胞病变在一定程度上有所减少，表明S-层蛋白对PEDV存在一定的竞争作用。
2.4 S-层蛋白对PEDV黏附和入侵VERO细胞的排斥黏附的影响
图15
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为15uL
图16
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为30uL时
在图15和16中：部分细胞肿胀变圆，拉长呈梭形，存在细胞间隙变大的现象，部分区域遮光性增强。
图17
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为45uL
图18
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为60uL
图17-18：细胞膜之间的间隙较为清晰，胞浆透明度良好，大部分细胞都有着完整的形态。
由以上观察分析得出：在图15和16中，细胞有轻微病变，在图17和18中没有明显的细胞病变，并在S-层蛋白剂量为45-60uL左右时达到最佳抑制效果。表明S-层蛋白对PEDV具有显著的排斥作用。
3 结论
PEDV对Vero细胞的生长存在一定的抑制作用。在S-层蛋白对Vero细胞生长无明显影响的情况下，S-层蛋白对PEDV黏附及入侵Vero细胞起到了一定拮抗作用，在排斥黏附试验中效果明显，并在其S-层蛋白剂量在45-60uL左右时达到了最佳效果。
4 讨论
有研究表明，DC-SIGN(II型跨膜凝集受体）可以识别结合HIV1、丙型肝炎病毒、埃博拉病毒、巨细胞病毒和SARS冠状病毒等。在病毒对细胞进行入侵时，DC-SIGN可以与细胞黏附因子2（ICAM-2)和ICAM-3结合，并能识别结合含高甘露糖的碳水化合物和含岩藻糖的多糖结构等病原相关分子模式。以细胞体外培养得出结果，S-层蛋白可以抑制这些病毒利用DC-SIGN对细胞的入侵，以预测S-层蛋白与病毒表面蛋白复制有关，这是S-层蛋白直接抑制病毒的首次报道[7]。本研究则证实了乳酸杆菌S-层蛋白对PEDV的黏附和入侵起到显著抑制作用。那么S-层蛋白对PEDV的作用机制会是什么呢？相比较竞争试验，排斥试验在拮抗病毒方面有更好的效果，说明S-层蛋白首先在Vero细胞表面进行自我组装，影响到PEDV表面蛋白的复制。这意味着S-层蛋白可能在病毒感染前期就起到了较好的抗病毒感染作用，这可能与S-蛋白和PEDV的复合体阻碍了病毒对Vero细胞的感染有关，进一步说明S-层蛋白可能具有预防病毒感染的效果，而其发挥抗病毒作用的时期为病毒入侵细胞之前。在本试验中，S-层蛋白在排斥黏附试验中抑制PEDV的黏附及入侵效果最好，进一步推断S-层蛋白可能在PEDV病毒表面的自我组装有关[8-9] 。此外，S-层蛋白在竞争试验中一定程度上抑制PEDV的黏附及入侵，提示S-层蛋白可能与PEDV黏附宿主细胞的受体存在竞争作用。我们应用提纯的嗜酸乳酸杆菌S-层蛋白在抑制猪流行腹泻病毒在Vero细胞的黏附及入侵上得到了一定的效果，并且S-层蛋白易于保存和运输，不具有耐药性，来源丰富，提取纯化技术也比较成熟，因此，S-层蛋白在将来很有希望成为猪流行性腹泻病药物和抗生素的替代品，从而应用于临床和饲料行业中去[10]。
致谢
感谢我的导师，大学杨倩教授为我提供了这次宝贵的研究学习机会，在课题设计、实验方法和实验技术上给予我莫大的帮助和指导。感谢江苏省农科院国家兽用生物制品工程技术研究中心的李鹏成博士与陈瑾硕士，他们对我悉心栽培，谆谆教导。他们的博学多识，学术研究的实事求是和严谨细致，让我受益良多。
感谢江苏省农科院国家兽用生物制品工程技术研究中心猪病二组实验室这个大家庭，感谢其他各位学姐及其他各位学长不辞辛苦，对我的试验尽心指导；同时对我的学习生活也十分关照，让我得以在温暖和谐的气氛中专心进行试验。也感谢和我一起实习的每个同学对我的帮助。
参考文献:
[1] 孙东波，马力等. 猪流行性腹泻病毒分子生物学研究进展[J].动物医学进展，2006,27(10).
[2] 李龙.仔猪流行性腹泻的最新流行情况[J].疫病防治，2012,10:40-41.
[3] Moorthy G,Murali MR，Devaraj SN. Protective role of lactobacilli in Shigella dysenteriae induced diarrhea in rats[J]. Nutrition，2007,23:424-433.
[4] Otero MC,Nader-Macias ME. Inhibition of Staphylococcus aureus by H2O2 -producing actobacillus gasseri isolated from the vaginal tract of cattle[J]. Animal Reproduction Science，2006，96:35-46.
[5] Wang B,Wei H，Yuan J，Li Q，Li Y，Li N，Li J. Identification of a surface protein from Lactobacillus reuteri JCM1081 that adheres to porcine gastric mucin and human enterocyte like HT229 cells[J]. Current Microbiology，2008，57 (1) :33-38.
[6] 王凡，李晓清等.乳酸杆菌S-层蛋白研究进展[J].中国饲料，2012.19:34-37
[7] María Guadalupe Martínez,Mariano Prado Acosta,Nélida A Candurra,Sandra M Ruzal.S-layer proteins of Lactobacillus acidophilus inhibits JUNV infection[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications ,2012，422 (4) :590-595.
[8] Johnson-Henry KC, Hagen KE, Gordonpour M, et al. Surface-layer protein extracts from Lactobacillus helveticus inhibit enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 adhesion to epithelial cells[J]. Cellular Microbiology, 2007, 9(2): 356-367.
[9] Pengcheng Li, Xiaolan Ye, Qian Yang. Antagonistic activity of Lactobacillus acidophilus S-layer proteins on Salmonella Typhimurium in Caco-2 cells[J]. Ann Microbiol, 2011, doi:10.1007/s13213-011-0327-1.
[10] 范郁冰,肖容等.乳酸菌S-层蛋白及其黏附性相关研究技术[J].食品科学，2012.33.01:294-297.
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
关键字:
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key Words 1
1 实验器材和方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株 2
1.1.2 仪器和试剂 2
1.2 乳酸杆菌的培养及乳酸杆菌S-层蛋白的提纯 2
1.2.1 乳酸杆菌的培养 2
1.2.2乳酸杆菌S-层蛋白的提纯? 2
1.3 细胞培养和试验设计 3
1.4 乳酸杆菌S-层蛋白对PEDV黏附和入侵VERO细胞的竞争黏附试验 3
1.5 乳酸杆菌S-层蛋白对PEDV黏附和入侵VERO细胞的排斥黏附试验 3
2 结果 3
2.1 S-层蛋白对Vero细胞生长的影响 4
2.2 S-层蛋白对PEDV的活性的影响 5
2.3 S-层蛋白对PEDV黏附和入侵VERO细胞的竞争黏附的影响 6
2.4 S-层蛋白对PEDV黏附和入侵VERO细胞的排斥黏附的影响 7
3 结论 8
4 讨论 8
致谢 9
参考文献 9
乳酸杆菌S-层蛋白对猪流行性腹泻病毒黏附和入侵Vero细胞的拮抗作用
摘要：【目的】研究乳酸杆菌中S-层蛋白（S-layer protein）是否能够拮抗猪流行性腹泻病毒（PEDV）黏附及入侵Vero细胞（非洲绿猴肾细胞）。【方法】首先提取并纯化乳酸杆菌的S-层蛋白；然后通过竞争黏附试验与排斥黏附试验，观察S-层蛋白对PEDV黏附和入侵Vero细胞的拮抗作用。【结果】竞争试验中S-层蛋白对PEDV的黏附入侵存在一定的拮抗作用；在排斥试验中发现，S-蛋白则能显著地抑制PEDV的黏附及入侵。【结论】乳酸杆菌S-层蛋白对PEDV可产生显著的拮抗作用，在排斥黏附试验中效果明显，这可能与S-层蛋白在Vero细胞表面的自我组装有关。
关键词 ：乳酸杆菌；S-层蛋白；PEDV；Vero细胞
The antagonism of the S-layer protein of lactic acid bacillus to the adhesion and invasion to VERO cell by PEDV
Student majoring in veterinary medicine WangXiaodong
Tutor Yang Qian
Abstract： [Objective] Lactobacillus S-layer protein is able to antagonize the porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) adhesion and invasion of Vero cells (African green monkey kidney cells). [Method] First extracted and purified Lactobacillus S-layer protein; then adhesion test adhesion test and exclusion through competition, antagonism was observed S-layer protein of PEDV adhesion and invasion of Vero cells. [Results] S-layer protein of competition test adhesion invasion of PEDV there is a certain antagonism; found in the exclusion test, S-protein could significantly inhibit the adhesion and invasion of PEDV. [Conclusion] Lactobacillus S-layer protein on PEDV can produce significant antagonism, adhesion test results in the exclusion of obvious, which may be S-layer protein in Vero cell surface self-assembly related.
Key Words： lactic acid bacillus；S-layer protein；PEDV；Vero cell
PEDV(猪流行腹泻病毒),属于冠状病毒科，冠状病毒属。该病毒经口和鼻感染后，直接进入小肠，存在于肠绒毛上皮细胞和肠系膜淋巴结，病毒的复制是在小肠和结肠绒毛上皮细胞浆中进行，是引起腹泻的主要原因。如果能阻止该病毒在肠上皮细胞表面的黏附定植，将有效地阻止PEDV对宿主的感染[1-2]。
乳酸杆菌是人类和动物肠道中一种正常的优势有益菌，具有重要的生理作用，可以调节肠道菌群，改善肠道微环境，提高机体免疫力等作用。此外乳酸杆菌还具有拮抗多种病原菌的作用，比如肠炎沙门氏菌，链球菌等[3-5]。乳酸杆菌外包裹一层呈晶格状排列结构的S-层蛋白（S-layer protein）。研究显示，乳酸杆菌拮抗病原菌的作用与S-层蛋白密切相关[6]。近来有学者报道，乳酸杆菌S-层蛋白可拮抗胡宁病毒（Junin virus，JUNV）的黏附及入侵。那么S-层蛋白是否对PEDV存在拮抗作用，国内外未见报道。
本研究首先提纯了乳酸杆菌的S-层蛋白，然后以Vero 细胞作为细胞模型，研究了S-层蛋白对PEDV黏附入侵的抑制。首先，进行VERO细胞的培养、传代以及乳酸杆菌的培养与收集；其次，对乳酸杆菌的S-层蛋白进行提纯、透析及其重悬；通过对VERO细胞进行接毒和添加S-层蛋白，摸索作用时间和添加S-蛋白的剂量，找到最佳的作用时间和蛋白剂量；最后通过细胞病变来评价S-层蛋白对PEDV黏附和入侵Vero细胞的拮抗作用。
1 实验器材和方法
1.1 材料：
1.1.1 菌株：
猪小肠分离的乳酸杆菌96株( 仅鉴定到乳酸杆菌属水平); PEDV(猪流行腹泻病毒)；以上均由江苏省农科院国家兽用生物制品工程技术研究中心猪病二组实验室提供；嗜乳酸杆菌ATCC4356(Lactobacillus acidophilus)，购自微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
1.1.2 仪器和试剂：
Tris HCl；NaCl；GSH(还原性)；GSSH(氧化性)；L精氨酸；VERO细胞株; 高糖DMEM 培养基(Gibco)； MRS肉汤；蒸馏水；洗脱柱；0.5mol/mL的NaCl溶液；96孔细胞培养板；琼脂糖凝胶电泳与SDS-PAGE凝胶电泳Marker与buffer；台式离心机；细胞培养瓶；超净台等；以上仪器与试剂均江苏省农科院提供；胰蛋白酶(Gibco)购自美国英骏公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。
1.2 乳酸杆菌的培养及乳酸杆菌S-层蛋白的提纯
1.2.1 乳酸杆菌的培养
首先配置MRS肉汤，剂量为1L。成分为:
蛋白陈????? 10.0g
牛肉粉????? 5.0g
酵母粉????? 4.0g
葡萄糖????? ?20.0g
吐温80? 1.0mL
磷酸氢二钾?? 2.0g
乙酸钠?????? 5.0g
柠檬酸三铵?? 2.0g
硫酸镁????? ?0.2g
硫酸锰?????? 0.05g
琼脂粉?????? 15.0g
蒸馏水?????? 1000mL?
将上述成分加人蒸馏水中,加热溶解,校正pH为6.2，装至1L培养瓶中，在 121℃下高压灭菌15min-20min。抽取7-8mL菌液到1L的MRS肉汤瓶中，37℃温箱培养过夜。由于乳酸杆菌为厌氧菌，培养时做好密封。
1.2.2乳酸杆菌S-层蛋白的提纯?
首先，对已经培养好的乳酸杆菌进行初步离心弃上清；用预冷的蒸馏水对沉淀进行重悬；再次离心（5000r，10min，4℃）弃上清；用10mL4M盐酸胍对沉淀进行重悬；对其进行摇床孵化（200r，37℃，1h）；再对其离心（13000r，15min，4℃），收集上清；对上清分别用4M、3M、2M、1M和0M盐酸胍进行透析。
其次，对乳酸杆菌S-层蛋白进行粗提，并将其粗提产物冻干，－20℃保存备用。
最后，对乳酸杆菌S-层蛋白进行纯化，本试验选取阴离子交换柱DE 52，常规装柱，0. 05 mol /L PB 缓冲液( pH 8. 0 )进行平衡;将粗提S-层蛋白冻干样品用上述缓冲液重悬过柱，收集蛋白洗脱峰;为减少蛋白损失，随即用0. 5 mol /L 的NaCl 洗脱，收集蛋白洗脱峰;用SDS-PAGE 分析验证提纯效果，S-层蛋白的终浓度为100mg/L。
1.3 细胞培养和试验设计
弃掉原细胞培养瓶中的旧细胞培养液，取10%DMEM培养液，抽取10mL加入细胞培养瓶中，并在细胞培养瓶中加入胎牛血清和双抗(链霉素、青霉素浓度均为100 U /mL) ，每隔48小时对其进行传代。接毒试验前一天将Vero细胞添加到96 孔培养板，细胞长成单层后使用。
在96孔板上Vero细胞长成单层后，弃掉旧培养液，于每孔分别加入100uL2%DMEM维持液。添加到细胞板的S-蛋白（终浓度100mg/L）梯度依次为15uL、30uL、45uL和60uL。并将96孔细胞板规划为6部分，分别做：病毒对照和空白对照、S-层蛋白对Vero细胞生长的影响、S-层蛋白对PEDV的活性影响、竞争黏附试验、排斥黏附试验。在每项试验做完后，将Vero细胞培养板放入温箱（37℃，5%CO2)进行培养，并在此后的1-3内天对Vero细胞进行观察并拍照分析。
1.4 乳酸杆菌S-层蛋白对PEDV黏附和入侵VERO细胞的竞争黏附试验
将S-层蛋白和PEDV同时加入到Vero细胞培养板，蛋白（终浓度100mg/L）梯度分别是上述梯度，每个处理设3个重复孔，病毒剂量都为200TCID50/ml。
1.5 乳酸杆菌S-层蛋白对PEDV黏附和入侵VERO细胞的排斥黏附试验
按上述蛋白（终浓度100mg/L）梯度，先将S-层蛋白依梯度添加到Vero细胞培养板中，每个处理设3个重复孔，放入温箱（37℃，5%CO2)中作用1小时，然后在Vero细胞培养板中添加PEDV各200TCID50/100uL。
2 结果
图1
病毒对照
在添加PEDV后，从图1可以看出，细胞病变特征为：细胞肿胀变圆，遮光性增强，颗粒物质增多，细胞大量脱落崩解，细胞间隙变大，细胞拉成网状。
图2
空白对照
在空白对照中（如图18所示）：Vero细胞生长良好，细胞膜界限清晰，胞浆透明度好，细胞形态完整。
2.1 S-层蛋白对Vero细胞生长的影响
将S-层蛋白按照上述蛋白（终浓度100mg/L）梯度添加到Vero细胞培养板中，每个处理设3个重复孔，再于Vero细胞培养板中加入2%DMEM维持液各100uL；意在验证S-层蛋白是否会对Vero细胞的生长产生影响。
图3
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为15uL
图4
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为30uL
图5
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为45uL
图6
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为60 uL
由以上观察得出（如图3、4、5和6所示）：Vero细胞生长状况良好，可以清晰的看到细胞膜之间的间隙，细胞有着完整的形态，胞浆透明度良好。这说明，在Vero细胞生长时添加S-层蛋白是对Vero细胞的生长无任何明显影响的。
2.2 S-层蛋白对PEDV的活性的影响
将S-层蛋白和PEDV首先在温箱（37℃，5%CO2)作用1小时，蛋白（终浓度100mg/L）梯度分别是上述梯度，每个处理设3个重复孔，病毒剂量都为200TCID50/ml。作用后将其加入Vero细胞培养板。
图7
S-层蛋白（终浓度100mg/L）剂量为15uL
图8
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为30uL
图9
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为45uL
图10
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为60uL
如图7-10所示：预先将不同剂量的S-层蛋白与PEDV作用后，PEDV在Vero细胞上引起的感染病变无明显差异，表明S-层蛋白对PEDV的活性没有明显影响。
2.3 S-层蛋白对PEDV黏附和入侵VERO细胞的竞争黏附的影响
图11
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为15uL
在图11中：部分细胞肿胀变圆，遮光性增强，某些区域颗粒物质增多，细胞间隙变大，细胞拉成网状。
图12
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为30uL
在图12中：在部分区域遮光性增强，少量细胞拉成网状。
图13
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为45uL
图14
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为60uL
在图13和14中：在部分区域可见颗粒物质增多，少量细胞呈梭形，胞浆透明度良好，细胞形态完整，细胞膜界限清晰，细胞形态基本完整。
由以上观察分析得出：在图11中能看到Vero细胞有明显的病变，图12-14细胞病变在一定程度上有所减少，表明S-层蛋白对PEDV存在一定的竞争作用。
2.4 S-层蛋白对PEDV黏附和入侵VERO细胞的排斥黏附的影响
图15
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为15uL
图16
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为30uL时
在图15和16中：部分细胞肿胀变圆，拉长呈梭形，存在细胞间隙变大的现象，部分区域遮光性增强。
图17
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为45uL
图18
蛋白（终浓度100mg/L）剂量为60uL
图17-18：细胞膜之间的间隙较为清晰，胞浆透明度良好，大部分细胞都有着完整的形态。
由以上观察分析得出：在图15和16中，细胞有轻微病变，在图17和18中没有明显的细胞病变，并在S-层蛋白剂量为45-60uL左右时达到最佳抑制效果。表明S-层蛋白对PEDV具有显著的排斥作用。
3 结论
PEDV对Vero细胞的生长存在一定的抑制作用。在S-层蛋白对Vero细胞生长无明显影响的情况下，S-层蛋白对PEDV黏附及入侵Vero细胞起到了一定拮抗作用，在排斥黏附试验中效果明显，并在其S-层蛋白剂量在45-60uL左右时达到了最佳效果。
4 讨论
有研究表明，DC-SIGN(II型跨膜凝集受体）可以识别结合HIV1、丙型肝炎病毒、埃博拉病毒、巨细胞病毒和SARS冠状病毒等。在病毒对细胞进行入侵时，DC-SIGN可以与细胞黏附因子2（ICAM-2)和ICAM-3结合，并能识别结合含高甘露糖的碳水化合物和含岩藻糖的多糖结构等病原相关分子模式。以细胞体外培养得出结果，S-层蛋白可以抑制这些病毒利用DC-SIGN对细胞的入侵，以预测S-层蛋白与病毒表面蛋白复制有关，这是S-层蛋白直接抑制病毒的首次报道[7]。本研究则证实了乳酸杆菌S-层蛋白对PEDV的黏附和入侵起到显著抑制作用。那么S-层蛋白对PEDV的作用机制会是什么呢？相比较竞争试验，排斥试验在拮抗病毒方面有更好的效果，说明S-层蛋白首先在Vero细胞表面进行自我组装，影响到PEDV表面蛋白的复制。这意味着S-层蛋白可能在病毒感染前期就起到了较好的抗病毒感染作用，这可能与S-蛋白和PEDV的复合体阻碍了病毒对Vero细胞的感染有关，进一步说明S-层蛋白可能具有预防病毒感染的效果，而其发挥抗病毒作用的时期为病毒入侵细胞之前。在本试验中，S-层蛋白在排斥黏附试验中抑制PEDV的黏附及入侵效果最好，进一步推断S-层蛋白可能在PEDV病毒表面的自我组装有关[8-9] 。此外，S-层蛋白在竞争试验中一定程度上抑制PEDV的黏附及入侵，提示S-层蛋白可能与PEDV黏附宿主细胞的受体存在竞争作用。我们应用提纯的嗜酸乳酸杆菌S-层蛋白在抑制猪流行腹泻病毒在Vero细胞的黏附及入侵上得到了一定的效果，并且S-层蛋白易于保存和运输，不具有耐药性，来源丰富，提取纯化技术也比较成熟，因此，S-层蛋白在将来很有希望成为猪流行性腹泻病药物和抗生素的替代品，从而应用于临床和饲料行业中去[10]。
致谢
感谢我的导师，大学杨倩教授为我提供了这次宝贵的研究学习机会，在课题设计、实验方法和实验技术上给予我莫大的帮助和指导。感谢江苏省农科院国家兽用生物制品工程技术研究中心的李鹏成博士与陈瑾硕士，他们对我悉心栽培，谆谆教导。他们的博学多识，学术研究的实事求是和严谨细致，让我受益良多。
感谢江苏省农科院国家兽用生物制品工程技术研究中心猪病二组实验室这个大家庭，感谢其他各位学姐及其他各位学长不辞辛苦，对我的试验尽心指导；同时对我的学习生活也十分关照，让我得以在温暖和谐的气氛中专心进行试验。也感谢和我一起实习的每个同学对我的帮助。
参考文献:
[1] 孙东波，马力等. 猪流行性腹泻病毒分子生物学研究进展[J].动物医学进展，2006,27(10).
[2] 李龙.仔猪流行性腹泻的最新流行情况[J].疫病防治，2012,10:40-41.
[3] Moorthy G,Murali MR，Devaraj SN. Protective role of lactobacilli in Shigella dysenteriae induced diarrhea in rats[J]. Nutrition，2007,23:424-433.
[4] Otero MC,Nader-Macias ME. Inhibition of Staphylococcus aureus by H2O2 -producing actobacillus gasseri isolated from the vaginal tract of cattle[J]. Animal Reproduction Science，2006，96:35-46.
[5] Wang B,Wei H，Yuan J，Li Q，Li Y，Li N，Li J. Identification of a surface protein from Lactobacillus reuteri JCM1081 that adheres to porcine gastric mucin and human enterocyte like HT229 cells[J]. Current Microbiology，2008，57 (1) :33-38.
[6] 王凡，李晓清等.乳酸杆菌S-层蛋白研究进展[J].中国饲料，2012.19:34-37
[7] María Guadalupe Martínez,Mariano Prado Acosta,Nélida A Candurra,Sandra M Ruzal.S-layer proteins of Lactobacillus acidophilus inhibits JUNV infection[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications ,2012，422 (4) :590-595.
[8] Johnson-Henry KC, Hagen KE, Gordonpour M, et al. Surface-layer protein extracts from Lactobacillus helveticus inhibit enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7 adhesion to epithelial cells[J]. Cellular Microbiology, 2007, 9(2): 356-367.
[9] Pengcheng Li, Xiaolan Ye, Qian Yang. Antagonistic activity of Lactobacillus acidophilus S-layer proteins on Salmonella Typhimurium in Caco-2 cells[J]. Ann Microbiol, 2011, doi:10.1007/s13213-011-0327-1.
[10] 范郁冰,肖容等.乳酸菌S-层蛋白及其黏附性相关研究技术[J].食品科学，2012.33.01:294-297.
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
关键字:
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key Words 1
1 实验器材和方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 菌株 2
1.1.2 仪器和试剂 2
1.2 乳酸杆菌的培养及乳酸杆菌S-层蛋白的提纯 2
1.2.1 乳酸杆菌的培养 2
1.2.2乳酸杆菌S-层蛋白的提纯? 2
1.3 细胞培养和试验设计 3
1.4 乳酸杆菌S-层蛋白对PEDV黏附和入侵VERO细胞的竞争黏附试验 3
1.5 乳酸杆菌S-层蛋白对PEDV黏附和入侵VERO细胞的排斥黏附试验 3
2 结果 3
2.1 S-层蛋白对Vero细胞生长的影响 4
2.2 S-层蛋白对PEDV的活性的影响 5
2.3 S-层蛋白对PEDV黏附和入侵VERO细胞的竞争黏附的影响 6
2.4 S-层蛋白对PEDV黏附和入侵VERO细胞的排斥黏附的影响 7
3 结论 8
4 讨论 8
致谢 9
参考文献 9
乳酸杆菌S-层蛋白对猪流行性腹泻病毒黏附和入侵Vero细胞的拮抗作用
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/1144.html
