不同富集培养条件下瘤胃氨生成与蛋白降解菌菌群结构比较分析
3采用体外继代富集培养方法研究不同富集培养条件下奶牛瘤胃氨生成及蛋白降解菌菌群结构差异。试验采用2×2因子设计，即两种氮源[酪蛋白（Cas）和胰酪蛋白胨（Try）和两种莫能菌素添加水平[0（C）和5μM（M）]，配制四种不同的富集培养基（Cas-C, Cas-M, Try-C, Try-M）。试验结果表明不同富集培养条件下，Try处理组氨氮浓度显著高于Cas处理，而添加莫能菌素处理组显著低于未添加处理组；莫能菌素及氮源组成形式显著影响菌群结构组成，Try-C处理中Peptostreptococcus占总菌数量比例高达41%，极显著高于其他三个处理组（P<0.05）；莫能菌素添加显著降低了总菌拷贝数，但不同氮源处理对总菌拷贝数没有影响，高效产氨菌C. sticklandii在不同富集培养物中均未检出，而C. aminophilum在未添加莫能菌素处理组得到富集。结论莫能菌素及氮源组成形式可通过影响菌群组成及数量进而影响瘤胃氨的生成，Try-C处理组Peptostreptococcus中特异性高效产氨菌的存在可能是造成氨浓度高于其它处理的主要原因。
目录
引言
引言
对于反刍动物来说，氮的平均利用效率仅为25%左右[1]，而瘤胃代谢被认为是造成氮无效利用最主要的因素[2]。研究表明高达一半的饲料氨基酸氮在瘤胃可被微生物降解产生氨[3]，由于氨的产生速率远远超过微生物的利用速率，造成过量的氨被动物吸收，在体内转化为尿素并大部分随尿液排出体外[4]。氮素的大量流失不仅造成饲料蛋白质资源浪费，而且加剧环境污染。瘤胃中高效产氨菌（hyper ammoniaproducing bacteria，HAB）产氨速率过快，是导致反刍动物氮利用效率低的主要原因之一[5]。在满足瘤胃内微生物对氨态氮需求的情况下尽可能避免饲料蛋白质在瘤胃分解是提高反刍动物氮利用效率的有效方法[6]。
反刍动物瘤胃内的氨基酸脱氨基作用主要由两种不同的细菌主导，其中一类细菌数量多，但每种细菌的脱氨基活性并不高；另一类细菌数量虽然较少，但每种细菌均具有很高的脱氨基活性和特异性，统称为HAB[7]。尽管第二类细菌数量不超过瘤胃细菌总量的5%, 但其产氨速率却是第一类细菌的2030倍[5]，约占瘤胃中总产氨能力的3550%[8]。至目前为止，已有多种 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
HAB被分离出来，虽然所有已分离出的HAB具有很多共同特征，如其生长依赖于氨基酸作为碳源和氮源、不能发酵碳水化合物、对莫能菌素敏感等，但鉴于HAB具有多种代谢类型，并且基因型也有较大差异，大量未纯培养的HAB可能还没有被发现，而它们在瘤胃脱氨基产氨过程中又可能起着非常重要的作用。
本研究目的是采用体外继代富集培养方法研究不同氮源条件下添加莫能菌素对奶牛瘤胃氨生成及蛋白降解菌菌群结构的影响，研究结果可深化对瘤胃高效产氨菌菌群结构和功能的认识，为反刍动物瘤胃氨的生成与调控提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验设计
试验采用2×2因子设计，即两种氮源[酪蛋白（Cas）和胰酪蛋白胨（Try）和两种莫能菌素添加水平[0（C）和5μM（M）]，配制四种不同的富集培养基（CasC, CasM, TryC, TryM）。
1.2母液及溶液
试验所需富集培养基原液及培养基配置表见表1和表2。所有溶液配置好后，储存于4℃。维生素溶液使用前需用0.22μm无菌滤膜过滤于灭菌的血清瓶中备用，两周内用完。
表1. 富集培养基原液配制表
微量元素溶液：
Na4EDTA:500mg; FeSO4.7H2O:200mg;
MnCl2.4H2O:200mg; ZnSO4.7H2O:10.0g;
H3BO3:30mg; CoCl2.6H2O:20mg;
CuCl2.2H2O:1mg; NiCl2.6H2O:2mg;
FeCl3.6H2O:8.0g;
加蒸馏水至100ml
0.1%（w/v）刃天青溶液：
100mg溶解于100ml蒸馏水
盐溶液 1：
K2 HPO4：1.46g;
加蒸馏水至1000ml
盐溶液2：
KH2PO4：1.46g
Na2SO4：2.4 g
NaCl：2.4g
MgSO4.7H2O：0.5g
CaCl2.2H2O：0.02g
加蒸馏水至1000ml
维生素溶液：
维生素B6:200mg ; 硫辛酸:100mg;
维生素B2:200mg; 对氨基苯甲酸:10mg;
维生素B1:200mg; 叶酸:5mg;
烟酰胺:200mg; 生物素:5mg;
泛酸:200mg; 辅酶B12:5mg;
加蒸馏水至1000ml
表2 富集培养基配制表（1000ml）
原 液
体积/重量
原 液
体积/重量
盐溶液1
200mL
微量元素溶液
10mL
盐溶液2
200mL
0.1%刃天青溶液
1mL
酪蛋白/蛋白胨
15g
半胱氨酸盐酸盐
0.6g
Na2CO3
4g
维生素溶液
0.1mL/10mL（灭菌后添加）
加蒸馏水定容至1000mL
1.3继代培养及样品采集
以3头安装有瘤胃瘘管的奶牛瘤胃液为接种材料，瘤胃液经四层纱布过滤后，接入到预先预热至39℃的四种富集培养基中，每个处理四个重复，间隔24h以10%（v/v）的接种量传代一次，连续传代6次。第1代0、6、12、24和48h采集培养液，用于氨氮浓度测定；第26代每次传代后立即采集24h培养物，用于氨氮浓度测定；同时提取第6代培养物DNA，采用高通量测序及Realtime PCR等分子技术分析富集培养物菌群结构。
1.4 样品分析
氨氮测定：采用比色法方法测定发酵液氨态氮浓度[9]。
DNA提取:解冻的样品涡旋2 min后，转移至2 mL新的无菌离心管中。然后在4°C以9 000×g离心5 min。弃去上清，沉淀用0.5 mL冰浴的无菌憐酸钠缓冲液(0.1 mmol/L, pH7.0)冲洗一遍后用 1 mL的无菌TrisHCl/EDTA缓冲液(10 mmol/L TrisHCl, 1 mmol/LEDTA钠；pH 7.6)悬浮。用珠磨法(beadbeating)及酚氯仿异戊醇抽提法提取样品中的总基因组DNA[10]，DNA经乙醇沉淀后用50μL的TE buffer70℃条件下震荡溶解5min。用Nanodrop测定DNA浓度。
高通量测序：部分DNA样品送美吉生物公司采用Illumina Miseq PE300进行高通量测序。
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引言
引言
对于反刍动物来说，氮的平均利用效率仅为25%左右[1]，而瘤胃代谢被认为是造成氮无效利用最主要的因素[2]。研究表明高达一半的饲料氨基酸氮在瘤胃可被微生物降解产生氨[3]，由于氨的产生速率远远超过微生物的利用速率，造成过量的氨被动物吸收，在体内转化为尿素并大部分随尿液排出体外[4]。氮素的大量流失不仅造成饲料蛋白质资源浪费，而且加剧环境污染。瘤胃中高效产氨菌（hyper ammoniaproducing bacteria，HAB）产氨速率过快，是导致反刍动物氮利用效率低的主要原因之一[5]。在满足瘤胃内微生物对氨态氮需求的情况下尽可能避免饲料蛋白质在瘤胃分解是提高反刍动物氮利用效率的有效方法[6]。
反刍动物瘤胃内的氨基酸脱氨基作用主要由两种不同的细菌主导，其中一类细菌数量多，但每种细菌的脱氨基活性并不高；另一类细菌数量虽然较少，但每种细菌均具有很高的脱氨基活性和特异性，统称为HAB[7]。尽管第二类细菌数量不超过瘤胃细菌总量的5%, 但其产氨速率却是第一类细菌的2030倍[5]，约占瘤胃中总产氨能力的3550%[8]。至目前为止，已有多种 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
HAB被分离出来，虽然所有已分离出的HAB具有很多共同特征，如其生长依赖于氨基酸作为碳源和氮源、不能发酵碳水化合物、对莫能菌素敏感等，但鉴于HAB具有多种代谢类型，并且基因型也有较大差异，大量未纯培养的HAB可能还没有被发现，而它们在瘤胃脱氨基产氨过程中又可能起着非常重要的作用。
本研究目的是采用体外继代富集培养方法研究不同氮源条件下添加莫能菌素对奶牛瘤胃氨生成及蛋白降解菌菌群结构的影响，研究结果可深化对瘤胃高效产氨菌菌群结构和功能的认识，为反刍动物瘤胃氨的生成与调控提供理论依据。
1材料与方法
1.1试验设计
试验采用2×2因子设计，即两种氮源[酪蛋白（Cas）和胰酪蛋白胨（Try）和两种莫能菌素添加水平[0（C）和5μM（M）]，配制四种不同的富集培养基（CasC, CasM, TryC, TryM）。
1.2母液及溶液
试验所需富集培养基原液及培养基配置表见表1和表2。所有溶液配置好后，储存于4℃。维生素溶液使用前需用0.22μm无菌滤膜过滤于灭菌的血清瓶中备用，两周内用完。
表1. 富集培养基原液配制表
微量元素溶液：
Na4EDTA:500mg; FeSO4.7H2O:200mg;
MnCl2.4H2O:200mg; ZnSO4.7H2O:10.0g;
H3BO3:30mg; CoCl2.6H2O:20mg;
CuCl2.2H2O:1mg; NiCl2.6H2O:2mg;
FeCl3.6H2O:8.0g;
加蒸馏水至100ml
0.1%（w/v）刃天青溶液：
100mg溶解于100ml蒸馏水
盐溶液 1：
K2 HPO4：1.46g;
加蒸馏水至1000ml
盐溶液2：
KH2PO4：1.46g
Na2SO4：2.4 g
NaCl：2.4g
MgSO4.7H2O：0.5g
CaCl2.2H2O：0.02g
加蒸馏水至1000ml
维生素溶液：
维生素B6:200mg ; 硫辛酸:100mg;
维生素B2:200mg; 对氨基苯甲酸:10mg;
维生素B1:200mg; 叶酸:5mg;
烟酰胺:200mg; 生物素:5mg;
泛酸:200mg; 辅酶B12:5mg;
加蒸馏水至1000ml
表2 富集培养基配制表（1000ml）
原 液
体积/重量
原 液
体积/重量
盐溶液1
200mL
微量元素溶液
10mL
盐溶液2
200mL
0.1%刃天青溶液
1mL
酪蛋白/蛋白胨
15g
半胱氨酸盐酸盐
0.6g
Na2CO3
4g
维生素溶液
0.1mL/10mL（灭菌后添加）
加蒸馏水定容至1000mL
1.3继代培养及样品采集
以3头安装有瘤胃瘘管的奶牛瘤胃液为接种材料，瘤胃液经四层纱布过滤后，接入到预先预热至39℃的四种富集培养基中，每个处理四个重复，间隔24h以10%（v/v）的接种量传代一次，连续传代6次。第1代0、6、12、24和48h采集培养液，用于氨氮浓度测定；第26代每次传代后立即采集24h培养物，用于氨氮浓度测定；同时提取第6代培养物DNA，采用高通量测序及Realtime PCR等分子技术分析富集培养物菌群结构。
1.4 样品分析
氨氮测定：采用比色法方法测定发酵液氨态氮浓度[9]。
DNA提取:解冻的样品涡旋2 min后，转移至2 mL新的无菌离心管中。然后在4°C以9 000×g离心5 min。弃去上清，沉淀用0.5 mL冰浴的无菌憐酸钠缓冲液(0.1 mmol/L, pH7.0)冲洗一遍后用 1 mL的无菌TrisHCl/EDTA缓冲液(10 mmol/L TrisHCl, 1 mmol/LEDTA钠；pH 7.6)悬浮。用珠磨法(beadbeating)及酚氯仿异戊醇抽提法提取样品中的总基因组DNA[10]，DNA经乙醇沉淀后用50μL的TE buffer70℃条件下震荡溶解5min。用Nanodrop测定DNA浓度。
高通量测序：部分DNA样品送美吉生物公司采用Illumina Miseq PE300进行高通量测序。
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