枯草芽孢杆菌表面活性素对树突状细胞作用的初探
枯草芽孢杆菌表面活性素（Surfactin）具有抗菌、抗病毒等生物活性。树突状细胞（Dendritic Cells，DC）是最强大的抗原递呈细胞，其成熟是诱导下游免疫应答的重要环节。因此，本试验检测了Surfactin刺激小鼠骨髓源DC后， DC形态、表型、迁移能力、刺激淋巴细胞增殖能力的变化，研究Surfactin对DC的作用。结果显示Surfactin能够使DC的形态指数、CD40和MHCⅡ表型表达水平、迁移能力以及刺激淋巴细胞增殖能力都极显著提高，说明Surfactin能诱导DC成熟。另外通过检测DC的IκB-α水平，发现Surfactin作用DC后IκB-α水平极显著降低，可以初步说明NF-κB信号通路在Surfactin诱导DC成熟的过程中起到重要作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 试验材料 3
1.1.1 试验动物3
1.1.2 仪器设备3
1.1.3 试剂耗材3
1.2 试验方法 3
1.2.1 分离培养小鼠骨髓源DC3
1.2.2 Surfactin安全使用剂量的确定4
1.2.3 显微镜观察DC形态变化4
1.2.4 流式测定DC表型变化4
1.2.5 CCL19小室验证DC迁移能力变化4
1.2.6混合淋巴细胞反应验证DC功能成熟变化5
1.2.7 Westernblot初探Surfactin作用DC机理5
1.3 数据处理方法 5
2 结果5
2.1 分离培养小鼠骨髓源DC的鉴定5
2.2 Surfactin安全使用剂量的确定6
2.3 Surfactin对DC形态的影响7
2.4 Surfactin对DC表型的影响7
2.5 Surfactin对DC迁移能力的影响8
2.6 Surfactin对DC刺激淋巴细胞增殖能力的影响8
2.7 Surfactin作用DC后对IκBα的影响8< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
br /> 3讨论 9
致谢10
参考文献10
7表面活性素对树突状细胞作用的初探
引言
表面活性素（Surfactin）是芽孢杆菌属产生的一种短肽类物质，由Arima等人[1]在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）IFO 3039发酵液中首次发现。Kakinuma等人[23]随后研究了Surfactin的结构，指出它是一种大环内酯类的脂肽，含有一条7个氨基酸的肽链，这一肽链通过内酯环与一个带有1315个碳原子的β羟基脂肪酸相连。Surfactin长脂肪酸链及肽链上的L亮氨酸2（LLeu2）、D亮氨酸3（DLeu3）、L缬氨酸4（LVal4）、D亮氨酸6（DLeu6）、L亮氨酸7（LLeu7）构成其亲油集团，环链骨架与L谷氨酸1（LGlu1）和L天冬氨酸5（LAsp5）2个酸性氨基酸残基构成亲水集团。Bonmatin等运用高分辨核磁共振氢谱结合分子动力学技术确定了Surfactin的三维结构。在水溶液中，Surfactin表现出一种典型的“马鞍形”结构[4]，位于同侧的氨基酸残基LLeu2和DLeu6彼此面对，2个酸性氨基酸LGlu1和LAsp5构成了一个较小的极性结构域，具有轻微的亲水能力。在另一侧，氨基酸残基DLeu3、LVal4和LLeu7与脂肪酸链构成主要的疏水结构域。两亲性化学结构使Surfactin表现出良好的表面活性和稳定性，仅需0.005%或更低浓度的Surfactin即可将双蒸水的表面张力从72mN/m降至27mN/m，其效果远优于十二烷基硫酸钠。Surfactin的临界胶束浓度约为1×105mol/L，远远低于许多化学合成的表面活性剂。枯草芽孢杆菌发酵产物中提取的脂肽Surfactin耐盐度高达21%，121℃高温处理2h后的表面活性和乳化能力仍保持稳定。Hwang等和孙立军等对Surfactin的生理毒性研究显示，Surfactin小鼠口服半数致死剂量（LD50）分别超过2500和5000mg/kg，急性毒性属实际低毒或无毒级，表明Surfactin具有较高的安全性。Surfactin是一种生物可降解的表面活性剂，这使得Surfactin在生物技术、环境保护等领域展现出巨大的应用潜力。Surfactin极强的表面活性能力赋予了它广泛的生物活性，比如抗菌、抗支原体、抗衣原体、抗病毒等。
树突状细胞（Dendritic Cells，DC）是美国学者Steinman和Cohn等于1973年首次在小鼠脾淋巴结中发现的[5]，因其在成熟时伸出许多树突状突起而得名。目前一致认为，凡具有典型的树突状形态，膜表面高表达MHCⅡ类分子，能移行至淋巴细胞器官和刺激初始型T细胞增殖活化，并具有一些相对特异性表面标志的一类细胞，才能称之为DC。DC广泛分布于全身各脏器，但数量少，除脑、心外，各组织中均可检出典型的DC，约占外周血白细胞总数的1%。DC是骨髓来源的白细胞，也可由血液中单核细胞甚至巨噬细胞衍生而来。DC是机体功能最强的专职抗原递呈细胞[6]，也是唯一一类可直接活化静息T细胞的专职抗原递呈细胞。DC能通过吞噬、胞饮方式摄取抗原，还能摄取和转运抗原的特殊膜受体，同时能够高效摄取低浓度抗原，是促进T、B淋巴细胞增殖的高效刺激因子。体内大部分DC处于未成熟状态，未成熟状态的DC具有强大的识别和捕获可吸入物质的能力，但表达共刺激因子和粘附因子的水平较低。当DC摄取抗原（包括体外加工）或受到某些因素刺激时会启动成熟过程，开始向局部的引流淋巴结迁移，激活初始T细胞，进而启动免疫应答。成熟的DC表达高水平的共刺激因子和粘附因子[7]，并且具有强大的抗原递呈能力[8]。当树突状细胞与细菌产物如LPS、细菌源性未甲基化的CpG二核苷酸、细胞因子TNFa、IL1相互作用后，它们就可以分化成熟并获得抗原呈递的能力。参与这个成熟过程的分子成分十分复杂。当MHCII类分子合成后即与高尔基后小泡结合，细胞质内蛋白质(包括某些细胞内寄生物和分枝杆菌)被降解成肽段后运送至这里。在HLADM分子的帮助下，恒定链短肽CLIP被降解，MHCII类分子肽结合槽暴露，抗原肽与MHCII类分子结合。然后完全装配好的MHCII肽复合体移动至浆膜激发T细胞应答。树突状细胞成熟后，其MHC分子、辅助刺激分子(CD40、CD80、CD86等)、黏附分子(如朗格汉斯细胞上的E钙粘连素)的表达显著提高，体外激发MLR的能力很强，但其抗原摄取加工能力大大降低。其趋化因子受体CCR7(EB病毒诱导分子I)的表达也增加，从而使它们能够对次级淋巴器官中生成的趋化因子、巨噬细胞炎症蛋白3p(MIP3p)等做出反应。DC在成熟过程中，同时发生迁移，由外周组织(获取抗原信号)通过淋巴管和(或)血循环进入次级淋巴器官，然后激发T细胞应答。而淋巴结中的成熟树突状细胞则通过表达MIP.3p来介导对初始T淋巴细胞的吸引。DC的成熟是诱导下游免疫应答的重要环节[9]。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法3
1.1 试验材料 3
1.1.1 试验动物3
1.1.2 仪器设备3
1.1.3 试剂耗材3
1.2 试验方法 3
1.2.1 分离培养小鼠骨髓源DC3
1.2.2 Surfactin安全使用剂量的确定4
1.2.3 显微镜观察DC形态变化4
1.2.4 流式测定DC表型变化4
1.2.5 CCL19小室验证DC迁移能力变化4
1.2.6混合淋巴细胞反应验证DC功能成熟变化5
1.2.7 Westernblot初探Surfactin作用DC机理5
1.3 数据处理方法 5
2 结果5
2.1 分离培养小鼠骨髓源DC的鉴定5
2.2 Surfactin安全使用剂量的确定6
2.3 Surfactin对DC形态的影响7
2.4 Surfactin对DC表型的影响7
2.5 Surfactin对DC迁移能力的影响8
2.6 Surfactin对DC刺激淋巴细胞增殖能力的影响8
2.7 Surfactin作用DC后对IκBα的影响8< *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
br /> 3讨论 9
致谢10
参考文献10
7表面活性素对树突状细胞作用的初探
引言
表面活性素（Surfactin）是芽孢杆菌属产生的一种短肽类物质，由Arima等人[1]在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）IFO 3039发酵液中首次发现。Kakinuma等人[23]随后研究了Surfactin的结构，指出它是一种大环内酯类的脂肽，含有一条7个氨基酸的肽链，这一肽链通过内酯环与一个带有1315个碳原子的β羟基脂肪酸相连。Surfactin长脂肪酸链及肽链上的L亮氨酸2（LLeu2）、D亮氨酸3（DLeu3）、L缬氨酸4（LVal4）、D亮氨酸6（DLeu6）、L亮氨酸7（LLeu7）构成其亲油集团，环链骨架与L谷氨酸1（LGlu1）和L天冬氨酸5（LAsp5）2个酸性氨基酸残基构成亲水集团。Bonmatin等运用高分辨核磁共振氢谱结合分子动力学技术确定了Surfactin的三维结构。在水溶液中，Surfactin表现出一种典型的“马鞍形”结构[4]，位于同侧的氨基酸残基LLeu2和DLeu6彼此面对，2个酸性氨基酸LGlu1和LAsp5构成了一个较小的极性结构域，具有轻微的亲水能力。在另一侧，氨基酸残基DLeu3、LVal4和LLeu7与脂肪酸链构成主要的疏水结构域。两亲性化学结构使Surfactin表现出良好的表面活性和稳定性，仅需0.005%或更低浓度的Surfactin即可将双蒸水的表面张力从72mN/m降至27mN/m，其效果远优于十二烷基硫酸钠。Surfactin的临界胶束浓度约为1×105mol/L，远远低于许多化学合成的表面活性剂。枯草芽孢杆菌发酵产物中提取的脂肽Surfactin耐盐度高达21%，121℃高温处理2h后的表面活性和乳化能力仍保持稳定。Hwang等和孙立军等对Surfactin的生理毒性研究显示，Surfactin小鼠口服半数致死剂量（LD50）分别超过2500和5000mg/kg，急性毒性属实际低毒或无毒级，表明Surfactin具有较高的安全性。Surfactin是一种生物可降解的表面活性剂，这使得Surfactin在生物技术、环境保护等领域展现出巨大的应用潜力。Surfactin极强的表面活性能力赋予了它广泛的生物活性，比如抗菌、抗支原体、抗衣原体、抗病毒等。
树突状细胞（Dendritic Cells，DC）是美国学者Steinman和Cohn等于1973年首次在小鼠脾淋巴结中发现的[5]，因其在成熟时伸出许多树突状突起而得名。目前一致认为，凡具有典型的树突状形态，膜表面高表达MHCⅡ类分子，能移行至淋巴细胞器官和刺激初始型T细胞增殖活化，并具有一些相对特异性表面标志的一类细胞，才能称之为DC。DC广泛分布于全身各脏器，但数量少，除脑、心外，各组织中均可检出典型的DC，约占外周血白细胞总数的1%。DC是骨髓来源的白细胞，也可由血液中单核细胞甚至巨噬细胞衍生而来。DC是机体功能最强的专职抗原递呈细胞[6]，也是唯一一类可直接活化静息T细胞的专职抗原递呈细胞。DC能通过吞噬、胞饮方式摄取抗原，还能摄取和转运抗原的特殊膜受体，同时能够高效摄取低浓度抗原，是促进T、B淋巴细胞增殖的高效刺激因子。体内大部分DC处于未成熟状态，未成熟状态的DC具有强大的识别和捕获可吸入物质的能力，但表达共刺激因子和粘附因子的水平较低。当DC摄取抗原（包括体外加工）或受到某些因素刺激时会启动成熟过程，开始向局部的引流淋巴结迁移，激活初始T细胞，进而启动免疫应答。成熟的DC表达高水平的共刺激因子和粘附因子[7]，并且具有强大的抗原递呈能力[8]。当树突状细胞与细菌产物如LPS、细菌源性未甲基化的CpG二核苷酸、细胞因子TNFa、IL1相互作用后，它们就可以分化成熟并获得抗原呈递的能力。参与这个成熟过程的分子成分十分复杂。当MHCII类分子合成后即与高尔基后小泡结合，细胞质内蛋白质(包括某些细胞内寄生物和分枝杆菌)被降解成肽段后运送至这里。在HLADM分子的帮助下，恒定链短肽CLIP被降解，MHCII类分子肽结合槽暴露，抗原肽与MHCII类分子结合。然后完全装配好的MHCII肽复合体移动至浆膜激发T细胞应答。树突状细胞成熟后，其MHC分子、辅助刺激分子(CD40、CD80、CD86等)、黏附分子(如朗格汉斯细胞上的E钙粘连素)的表达显著提高，体外激发MLR的能力很强，但其抗原摄取加工能力大大降低。其趋化因子受体CCR7(EB病毒诱导分子I)的表达也增加，从而使它们能够对次级淋巴器官中生成的趋化因子、巨噬细胞炎症蛋白3p(MIP3p)等做出反应。DC在成熟过程中，同时发生迁移，由外周组织(获取抗原信号)通过淋巴管和(或)血循环进入次级淋巴器官，然后激发T细胞应答。而淋巴结中的成熟树突状细胞则通过表达MIP.3p来介导对初始T淋巴细胞的吸引。DC的成熟是诱导下游免疫应答的重要环节[9]。
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