pax37对鸡胚胎期肌肉发育调节的研究
鸡肌纤维在出生后仅表现为体积的增加，其数目在胚胎期就已经确定。为了探讨Pax家族基因在胚胎阶段的表达规律，本研究以萨索鸡为实验素材，采用PCR技术检测Pax3/7基因在鸡胚胎期胸肌、腿肌中的表达情况，探索该家族基因的表达与肌纤维早期发育之间的关系。结果显示，Pax3基因在胸肌中的表达高峰期出现在胚胎期9-15天左右，之后迅速下降，并保持稳定；在腿肌中的表达高峰期出现在胚胎期12天左右。Pax7基因的表达趋势与Pax3基因基本一致。以上结果表明，Pax3和Pax7基因参与鸡胚胎期胸肌和腿肌的发育，Pax3/7基因表达的分析研究为进一步深入研究基因在胚胎期肌纤维发生过程及其调控机理中的功能提供一定的理论依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1文献综述1
1.1骨骼肌发育及其调控因子1
1.2 Pax3基因的研究进展 2
1.2.1 Pax家族基因介绍 2
1.2.2 Pax3基因研究概况 2
1.2.3 Pax7基因研究概况 2
1.3 研究意义 2
2引言2
3材料与方法 3
3.1实验材料 3
3.2实验方法 3
3.2.1总RNA提取3
3.2.2cDNA合成3
3.2.3设计引物3
3.2.4PCR扩增4
3.2.5 琼脂糖凝胶电泳4
3.2.6 免疫荧光染色4
4结果与分析4
4.1Pax7在胚胎期肌纤维中的表达情况4
4.2Pax3/7在胚胎期肌纤维中的表达情况6
5讨论7
5.1Pax3/7对鸡胚胎骨骼肌发育和肉质影响8
5.2前景展望 8
致谢8
参考文献8
Pax3/7对鸡胚胎期肌肉发育调节的研究
引言
畜禽的育种工作在过去的许多年里发展迅速，在日增重、抗病性等方面效果显著，但是随着人们生活水平的提高，对肉品质的需求也日益增加，用传统的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
育种选育方法很难在短期内满足这项需求，因此候选基因法对畜禽肉品质量的调控作用已经成为新的育种研究目标。
Pax3/7是肌肉发育的早期阶段中必不可少的基因，研究Pax3/7在鸡胚胎期的发育调节具有重要意义，有必要对肌纤维的发育规律进行深入研究。以往的研究大都集中在肉品表观指标的分析和宰后肉品的加工上，对影响肌肉生长发育的分子调控机理研究较少[18]。
3 材料与方法
3．1 实验材料
3．1．1 实验样品 萨索鸡种蛋选自新概念公司，编号同批孵化。孵化温度37摄氏度，湿度70%，分别于9、12、15、18、20胚龄时照蛋检验并随机选取正常发育的胚蛋14枚，进行胸肌与腿肌部分的采样。用DEPC水处理，编号保存于80℃冰箱中。
3．1．2 主要实验试剂 RNA 提取试剂 Trizol （ TaKaRa ）、反转录试剂盒（primerScriptTM RT reagent Kit）、荧光定量试剂盒HairpinitTM miRNAs qPCRQuantitation Kit、2×PCR Master Mix、DNA Marker1、0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)溶液、10×TBE、PBS缓冲液
3．1．3 实验仪器 孵化箱、低温离心机、匀浆机、普通PCR仪、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统等
3．2 实验方法
3．2．1 总RNA提取
取不同时期肌肉组织样品，加1 ml Trizol到细胞中，轻轻吹打。
匀浆后室温静置5min(试剂预冷)。
每1 ml Trizol加氯仿0.2μl，震荡15s，静置5min。
在4℃下，12,000 rpm离心15分钟，离心后管内分三相：下层红色的酚相，中间层为氯仿相，上层为无色的水相；
小心吸取上层水相至DEPC处理过的新EP管中。
加入等体积的异丙醇，沉淀水相中的RNA,上下颠倒混匀，室温放置15分钟，4℃，以12,000 rpm离心10分钟后，有白色胶状物沉在管底；
弃异丙醇后，用1.5 ml 75%的乙醇清洗沉淀，剧烈震荡，于4℃以7500 rpm离心10分钟，用微量移液器尽可能将乙醇吸尽，于超净台内放置风干（15分钟左右，切记不可让RNA沉淀过度风干）；
总RNA浓度的测定：用紫外分光光度计（Nanodrop）检测OD260及OD280的值，计算RNA的浓度及OD260/OD280的比值。OD260/OD280（A260/280）可以反映RNA的纯度，1.8～2.1为纯度良好。总RNA浓度（mg/ml）= OD260 × 40× 稀释倍数。
总RNA完整性检测：取2 μl总RNA提取液，用1.5% 琼脂糖凝胶进行电泳（电泳槽，制胶板应先经甲醛处理），观察RNA提取情况，判断RNA的完整性。完整的真核细胞总RNA可见到28 S、18 S两条带。
3．2．2 cDNA的合成
取一灭菌的无RNA酶的EP管，加入1 μg RNA模板和1 μl Oligo (dT) 引物，再加入适量 DEPC水至12 μl；
稍离心，70℃水浴5 min，迅速置于冰上冷却至室温；
依次加入1 μl的RNA酶抑制剂、4 μl的5×Reaction buffer、2 μl的dNTP，稍离心沉淀液体，37℃水浴5 min；
加入MMLV反转录酶（200 U/ml）1 μl，稍离心；
42℃水浴60 min， 70℃水浴5 min终止反应；冰上迅速冷却，所得引物即为cDNA。
3．2．3 用Primer 5.0软件设计引物 送至上海生工生物工程技术服务有限公司合成。各引物信息见表格1。
表1 PCR引物
引物
序列（5’3’）
Betaactin
F:ATGAAGCCCAGAGCAAAAGA
R:GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA
Pax3
F: CCAACCAACTGATGGCTTTT
R:CTGCTCTCTGGGTTTGAAGG
Pax7
F:AGTTCGATTAGCCGTGTGCT
R:CTCTTCAAAGGCAGGTCTGG
3．2．4 PCR的扩增
反应体系为20 μl
cDNA模板
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
1文献综述1
1.1骨骼肌发育及其调控因子1
1.2 Pax3基因的研究进展 2
1.2.1 Pax家族基因介绍 2
1.2.2 Pax3基因研究概况 2
1.2.3 Pax7基因研究概况 2
1.3 研究意义 2
2引言2
3材料与方法 3
3.1实验材料 3
3.2实验方法 3
3.2.1总RNA提取3
3.2.2cDNA合成3
3.2.3设计引物3
3.2.4PCR扩增4
3.2.5 琼脂糖凝胶电泳4
3.2.6 免疫荧光染色4
4结果与分析4
4.1Pax7在胚胎期肌纤维中的表达情况4
4.2Pax3/7在胚胎期肌纤维中的表达情况6
5讨论7
5.1Pax3/7对鸡胚胎骨骼肌发育和肉质影响8
5.2前景展望 8
致谢8
参考文献8
Pax3/7对鸡胚胎期肌肉发育调节的研究
引言
畜禽的育种工作在过去的许多年里发展迅速，在日增重、抗病性等方面效果显著，但是随着人们生活水平的提高，对肉品质的需求也日益增加，用传统的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
育种选育方法很难在短期内满足这项需求，因此候选基因法对畜禽肉品质量的调控作用已经成为新的育种研究目标。
Pax3/7是肌肉发育的早期阶段中必不可少的基因，研究Pax3/7在鸡胚胎期的发育调节具有重要意义，有必要对肌纤维的发育规律进行深入研究。以往的研究大都集中在肉品表观指标的分析和宰后肉品的加工上，对影响肌肉生长发育的分子调控机理研究较少[18]。
3 材料与方法
3．1 实验材料
3．1．1 实验样品 萨索鸡种蛋选自新概念公司，编号同批孵化。孵化温度37摄氏度，湿度70%，分别于9、12、15、18、20胚龄时照蛋检验并随机选取正常发育的胚蛋14枚，进行胸肌与腿肌部分的采样。用DEPC水处理，编号保存于80℃冰箱中。
3．1．2 主要实验试剂 RNA 提取试剂 Trizol （ TaKaRa ）、反转录试剂盒（primerScriptTM RT reagent Kit）、荧光定量试剂盒HairpinitTM miRNAs qPCRQuantitation Kit、2×PCR Master Mix、DNA Marker1、0.1% DEPC(焦碳酸二乙酯)溶液、10×TBE、PBS缓冲液
3．1．3 实验仪器 孵化箱、低温离心机、匀浆机、普通PCR仪、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统等
3．2 实验方法
3．2．1 总RNA提取
取不同时期肌肉组织样品，加1 ml Trizol到细胞中，轻轻吹打。
匀浆后室温静置5min(试剂预冷)。
每1 ml Trizol加氯仿0.2μl，震荡15s，静置5min。
在4℃下，12,000 rpm离心15分钟，离心后管内分三相：下层红色的酚相，中间层为氯仿相，上层为无色的水相；
小心吸取上层水相至DEPC处理过的新EP管中。
加入等体积的异丙醇，沉淀水相中的RNA,上下颠倒混匀，室温放置15分钟，4℃，以12,000 rpm离心10分钟后，有白色胶状物沉在管底；
弃异丙醇后，用1.5 ml 75%的乙醇清洗沉淀，剧烈震荡，于4℃以7500 rpm离心10分钟，用微量移液器尽可能将乙醇吸尽，于超净台内放置风干（15分钟左右，切记不可让RNA沉淀过度风干）；
总RNA浓度的测定：用紫外分光光度计（Nanodrop）检测OD260及OD280的值，计算RNA的浓度及OD260/OD280的比值。OD260/OD280（A260/280）可以反映RNA的纯度，1.8～2.1为纯度良好。总RNA浓度（mg/ml）= OD260 × 40× 稀释倍数。
总RNA完整性检测：取2 μl总RNA提取液，用1.5% 琼脂糖凝胶进行电泳（电泳槽，制胶板应先经甲醛处理），观察RNA提取情况，判断RNA的完整性。完整的真核细胞总RNA可见到28 S、18 S两条带。
3．2．2 cDNA的合成
取一灭菌的无RNA酶的EP管，加入1 μg RNA模板和1 μl Oligo (dT) 引物，再加入适量 DEPC水至12 μl；
稍离心，70℃水浴5 min，迅速置于冰上冷却至室温；
依次加入1 μl的RNA酶抑制剂、4 μl的5×Reaction buffer、2 μl的dNTP，稍离心沉淀液体，37℃水浴5 min；
加入MMLV反转录酶（200 U/ml）1 μl，稍离心；
42℃水浴60 min， 70℃水浴5 min终止反应；冰上迅速冷却，所得引物即为cDNA。
3．2．3 用Primer 5.0软件设计引物 送至上海生工生物工程技术服务有限公司合成。各引物信息见表格1。
表1 PCR引物
引物
序列（5’3’）
Betaactin
F:ATGAAGCCCAGAGCAAAAGA
R:GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA
Pax3
F: CCAACCAACTGATGGCTTTT
R:CTGCTCTCTGGGTTTGAAGG
Pax7
F:AGTTCGATTAGCCGTGTGCT
R:CTCTTCAAAGGCAGGTCTGG
3．2．4 PCR的扩增
反应体系为20 μl
cDNA模板
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