猪传染性胸膜肺炎放线杆菌rtx蛋白和omp外膜蛋白的可溶性表达与纯化
为了开发有效防控猪传染性胸膜肺炎的亚单位疫苗，通过传染性胸膜肺炎放线杆菌的RTX毒素基因和外膜蛋白（OMP）基因定向克隆到原核表达载体pColdI、pET-32a、pET-28a、pET-32aM、pCold-ProS2中，获得阳性基因重组质粒，转化原核表达宿主菌Rosetta并优化诱导条件，使其在大肠杆菌中多为可溶性表达，SDS-PAGE电泳分析发现，重组蛋白apxII、OMP以表达在上清为主，经Western blot鉴定纯化后的蛋白，结果表明纯化后的蛋白可被抗His的单克隆抗体识别，该研究的成功开展为后续制备抗血清和亚单位疫苗打下良好基础。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1材料与方法 2
1.1材料 2
1.1.1主要试剂 2
1.1.2仪器 2
1.2方法 2
1.2.1重组质粒的构建 2
1.2.1.1 目的片段与载体双酶切、跑胶回收、连接转化涂板 2
1.2.1.2 单菌落PCR、双酶切鉴定，提质粒转化 3
1.2.3重组质粒的原核表达、可溶性鉴定及Westernblot 检测 3
1.2.3.1原核表达 3
1.2.3.2可溶性鉴定 3
1.2.3.3 Westernblot 检测 3
1.2.4 目的蛋白的纯化 3
1.2.4.1小量纯化 3
1.2.4.2Ni柱大量纯化 4
2 结果与分析 4
2.1 重组质粒双酶切鉴定 4
2.2 重组蛋白的可溶性表达优化 5
2.3 重组蛋白的纯化 5
3讨论 5
3.1 RTX毒素基因和OMP外膜蛋白基因的克隆 6
3.2 RTX毒素基因和OMP外膜蛋白基因的表达 7
3.3 RTX毒素基因和OMP外膜蛋白基因的纯化 8
致谢 8
参考文献 8
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌RTX蛋白和OMP外膜蛋白的可溶性表达与纯化 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
引言
引言
猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilus pleuropneumoniae, APP)引起的一种猪的高度接触性传染病。该病主要病变特征以肺出血、坏死和纤维素性渗出等为主。它可致各年龄段的猪只发生急性、亚急性和慢性感染，发病率和死亡率很高，最急性型的死亡率可高达80%。慢性猪传染性膜肺炎潜伏于猪群内，猪群内的猪只生长缓慢，平均日增重下降，肉料比降低，给养猪业造成巨大损失[1]。针对胸膜肺炎放线杆菌血清型众多,现有疫苗缺乏交叉保护力,对规模化养猪业造成巨大经济损失的现状,研究开发具有交叉保护力的新型疫苗迫在眉睫。研究发现APP分泌的Apx毒素（apxI、apxII、apxIII）和外膜蛋白（OMP）是APP的主要毒力因子,他们已经作为4个重要的候选抗原应用于亚单位疫苗的研究[2]。天然提取的APP毒力因子因产量低、过程繁琐且成本较高难以应用到生产,利用体外克隆表达编码Apx毒素结构蛋白和OMP的基因，获得的重组蛋白与天然提取的毒力因子免疫原性无明显差异，可为下一步新型疫苗和ELISA诊断抗原的研究打下基础[3]。
App属于巴氏杆菌科、放线杆菌属，是一种革兰氏阴性小球杆菌，有荚膜和菌毛，不形成芽孢，其毒力因子为主要的免疫原。新鲜病料中的菌呈两极染色，人工培养24小时可见到丝状菌。本菌为兼性氧菌,在10% CO2条件下，可长成粘液状菌落。App的主要毒力因子包括荚膜、脂多糖、外膜蛋白、黏附素和Apx毒素等[4]。
App产生的溶血外毒素Apx被认为是App最重要的毒力因子，不分泌或缺失Apx的App菌株对猪和小鼠均不致病，缺失株补充了Apx的结构和分泌基因后可恢复原来的毒力，而且Apx气管灌注可以直接引起App的临床症状和肺部病变[5]。目前在App中已发现4种不同的Apx，它们具有溶细胞作用和溶血活性，属于细胞孔形成蛋白家族的含重复子毒素RTX。RTX毒素一般具有细胞特异和种特异的溶血性、白细胞毒性和白细胞刺激性等作用。App产生四种不同的RTX毒素,即apxI、apxII、apxIII和apxIV。apxI、apxII、apxIII对于疾病临床症状的出现以及典型的肺部病变是必需的，这三种毒素在体内和体外都能表达[6]。
OMP是App的另一个重要的毒力因子，在保证物质运输、与 F 因子接合等方面起到重要作用。针对OMP的抗体具有调理活性，因而OMP是App一种重要的保护性抗原[7]。
本试验将RTX蛋白和OMP外膜蛋白作为研究对象，挑选合适的载体和诱导条件，以期能在上清中大量表达，为制备抗血清和亚单位疫苗奠定良好基础。
1材料与方法
材料
1.1.1主要试剂 DNA回收试剂盒在 Bioflux公司购买。质粒提取试剂盒购自Biomiga，限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。携带有表达伴侣分子质粒的宿主菌pGKJE8、pGro7、pKJE7、pGTf2、pTf16，表达载体pET32a(+)、pET28a(+)、pET32aM(+)、PcoldProS2、目的片段上下游引物、大肠杆菌 DH5α 和Rosseta 由笔者所在实验室保存。IPTG（异丙基βD硫代吡喃半乳糖苷）、氨苄青霉素、氯霉素、四环素、卡那霉素购自 Biosharp公司。HRP 标记的山羊抗小鼠抗体购自武汉博士德生物工程公司。His 标签鼠单抗购自 Abmart 公司。
1.1.2仪器 CO2细胞培养箱（Thermo公司）；高速冷冻离心机（德国Andreas Hettich GmbH8 CO.KG）；UNIC型分光光度计（尤尼柯公司）；核酸浓度测定仪（Eppendorf Biophotometer）；SDSPAGE凝胶转印槽（BioRad）；Mini TransBlot转印槽（BioRad）；电泳仪（BioRad）。
1. 2方法
1.2.1重组质粒的构建
1.2.1.1 目的片段与载体双酶切、跑胶回收、连接转化涂板
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1材料与方法 2
1.1材料 2
1.1.1主要试剂 2
1.1.2仪器 2
1.2方法 2
1.2.1重组质粒的构建 2
1.2.1.1 目的片段与载体双酶切、跑胶回收、连接转化涂板 2
1.2.1.2 单菌落PCR、双酶切鉴定，提质粒转化 3
1.2.3重组质粒的原核表达、可溶性鉴定及Westernblot 检测 3
1.2.3.1原核表达 3
1.2.3.2可溶性鉴定 3
1.2.3.3 Westernblot 检测 3
1.2.4 目的蛋白的纯化 3
1.2.4.1小量纯化 3
1.2.4.2Ni柱大量纯化 4
2 结果与分析 4
2.1 重组质粒双酶切鉴定 4
2.2 重组蛋白的可溶性表达优化 5
2.3 重组蛋白的纯化 5
3讨论 5
3.1 RTX毒素基因和OMP外膜蛋白基因的克隆 6
3.2 RTX毒素基因和OMP外膜蛋白基因的表达 7
3.3 RTX毒素基因和OMP外膜蛋白基因的纯化 8
致谢 8
参考文献 8
猪传染性胸膜肺炎放线杆菌RTX蛋白和OMP外膜蛋白的可溶性表达与纯化 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
引言
引言
猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilus pleuropneumoniae, APP)引起的一种猪的高度接触性传染病。该病主要病变特征以肺出血、坏死和纤维素性渗出等为主。它可致各年龄段的猪只发生急性、亚急性和慢性感染，发病率和死亡率很高，最急性型的死亡率可高达80%。慢性猪传染性膜肺炎潜伏于猪群内，猪群内的猪只生长缓慢，平均日增重下降，肉料比降低，给养猪业造成巨大损失[1]。针对胸膜肺炎放线杆菌血清型众多,现有疫苗缺乏交叉保护力,对规模化养猪业造成巨大经济损失的现状,研究开发具有交叉保护力的新型疫苗迫在眉睫。研究发现APP分泌的Apx毒素（apxI、apxII、apxIII）和外膜蛋白（OMP）是APP的主要毒力因子,他们已经作为4个重要的候选抗原应用于亚单位疫苗的研究[2]。天然提取的APP毒力因子因产量低、过程繁琐且成本较高难以应用到生产,利用体外克隆表达编码Apx毒素结构蛋白和OMP的基因，获得的重组蛋白与天然提取的毒力因子免疫原性无明显差异，可为下一步新型疫苗和ELISA诊断抗原的研究打下基础[3]。
App属于巴氏杆菌科、放线杆菌属，是一种革兰氏阴性小球杆菌，有荚膜和菌毛，不形成芽孢，其毒力因子为主要的免疫原。新鲜病料中的菌呈两极染色，人工培养24小时可见到丝状菌。本菌为兼性氧菌,在10% CO2条件下，可长成粘液状菌落。App的主要毒力因子包括荚膜、脂多糖、外膜蛋白、黏附素和Apx毒素等[4]。
App产生的溶血外毒素Apx被认为是App最重要的毒力因子，不分泌或缺失Apx的App菌株对猪和小鼠均不致病，缺失株补充了Apx的结构和分泌基因后可恢复原来的毒力，而且Apx气管灌注可以直接引起App的临床症状和肺部病变[5]。目前在App中已发现4种不同的Apx，它们具有溶细胞作用和溶血活性，属于细胞孔形成蛋白家族的含重复子毒素RTX。RTX毒素一般具有细胞特异和种特异的溶血性、白细胞毒性和白细胞刺激性等作用。App产生四种不同的RTX毒素,即apxI、apxII、apxIII和apxIV。apxI、apxII、apxIII对于疾病临床症状的出现以及典型的肺部病变是必需的，这三种毒素在体内和体外都能表达[6]。
OMP是App的另一个重要的毒力因子，在保证物质运输、与 F 因子接合等方面起到重要作用。针对OMP的抗体具有调理活性，因而OMP是App一种重要的保护性抗原[7]。
本试验将RTX蛋白和OMP外膜蛋白作为研究对象，挑选合适的载体和诱导条件，以期能在上清中大量表达，为制备抗血清和亚单位疫苗奠定良好基础。
1材料与方法
材料
1.1.1主要试剂 DNA回收试剂盒在 Bioflux公司购买。质粒提取试剂盒购自Biomiga，限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。携带有表达伴侣分子质粒的宿主菌pGKJE8、pGro7、pKJE7、pGTf2、pTf16，表达载体pET32a(+)、pET28a(+)、pET32aM(+)、PcoldProS2、目的片段上下游引物、大肠杆菌 DH5α 和Rosseta 由笔者所在实验室保存。IPTG（异丙基βD硫代吡喃半乳糖苷）、氨苄青霉素、氯霉素、四环素、卡那霉素购自 Biosharp公司。HRP 标记的山羊抗小鼠抗体购自武汉博士德生物工程公司。His 标签鼠单抗购自 Abmart 公司。
1.1.2仪器 CO2细胞培养箱（Thermo公司）；高速冷冻离心机（德国Andreas Hettich GmbH8 CO.KG）；UNIC型分光光度计（尤尼柯公司）；核酸浓度测定仪（Eppendorf Biophotometer）；SDSPAGE凝胶转印槽（BioRad）；Mini TransBlot转印槽（BioRad）；电泳仪（BioRad）。
1. 2方法
1.2.1重组质粒的构建
1.2.1.1 目的片段与载体双酶切、跑胶回收、连接转化涂板
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