火鸡疱疹病毒miniF重组毒的构建与纯化
火鸡疱疹病毒miniF重组毒的构建与纯化[20200507184530]
摘要：火鸡疱疹病毒miniF重组毒（HVT-miniF）的构建与纯化是获得火鸡疱疹病毒细菌人工染色体（HVT-BAC）过程中最重要的一步。本试验首先构建了含有HVT Us2位点上下同源臂miniF转移质粒载体，通过同源重组转染CEF细胞，将miniF元件插入到HVT基因组Us2非必需位点；然后通过荧光下挑斑纯化、破碎细胞释放病毒和霉酚酸压力筛选等方案，将重组毒HVT-miniF从亲本毒株中成功纯化出来，对构建火鸡疱疹病毒细菌人工染色体做好准备，为火鸡疱疹病毒活病毒载体基因工程疫苗的开发奠定基础。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:HVT-miniF；构建；纯化
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言（或绪论） 1
1 材料与方法 2
1．1 菌株、质粒和培养基 2
1．2 主要试剂和仪器 2
1．3 载体构建 2
1．4 鸡胚成纤维细胞的培养和传代 2
1．4．1 细胞培养 2
1．4．2 细胞传代 2
1．5 转移载体和HVT基因组的鸡胚CEF细胞转染 2
1．6 HVT-miniF重组毒的筛选与纯化 2
1．6．1 传代培养 3
1．6．2 挑斑纯化 3
1．6．3 超声破碎纯化 3
1．6．4 反复冻融纯化 3
2 结果与分析 3
2．1 转移载体pUC19-H1-miniF-H2质粒的构建和验证 3
2．1．1 pUC19-H1质粒的构建和验证 3
2．1．2 pUC19-H1-H2质粒的构建和验证 4
2．1．3 pUC19-H1-H2-miniF质粒的构建与验证 4
2．2 鸡胚成纤维细胞的培养和传代 4
2．3 转移载体和HVT基因组的鸡胚CEF细胞转染 5
2．4 HVT-miniF重组毒的筛选与纯化 5
2．4．1 荧光挑斑纯化 5
2．4．2 超声破碎后加压筛选 5
2．4．3 反复冻融后加压筛选 5
3 讨论 5
致谢 6
参考文献 7
火鸡疱疹病毒miniF重组毒的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
构建与纯化
动物医学学生 黄恺
引言
火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of Turkey, HVT)是近年来研究开发并逐渐转向实际应用的一种新病毒载体, 与其它禽病毒载体相比具有许多优势:一方面安全性高，HVT病毒载体对家禽无致病性，还能很好的预防马立克疾病；另一方面免疫效果好，接种后病毒在鸡体内形成长达数周的病毒血症, 且终生潜伏感染,能刺激机体产生较高的抗体水平并维持终生, 从而抗体持续时间长。此外，HVT 基因组庞大, 非必需区域多，不但可以插入较长的外源基因,还可以插入多个不同的抗原片段用于构建多价或多联重组病毒活疫苗；HVT疫苗不仅生产成本低, 而且可以冻干，易于贮存和运输。目前, 国外已成功地利用HVT作为载体表达了多种禽病原保护性抗原基因, 展现了HVT作为载体疫苗的良好应用前景[1-3]。
由于HVT结构复杂，并且具有微强的细胞结合特性，使得以前在直核细胞中的同源重组操作技术对其进行操作和研究，显得费时费力困难重重。近年来，细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)技术在疱疹病毒上的应用解决了这一难题[4]。通过构建HVT-BAC，就可以在火肠杆菌中对HVT基因组进行遗传修饰。与在真核细胞中相比，在人肠杆菌中操作的重组技术具有更快速、有效、可靠的优点，尤其是最近发展起来的“Red/ET重组”技术在BAC修饰上的应用，更是促进了BAC技术的快速发展。
miniF是BAC质粒构建中的重要元件，它本是大肠杆菌的F性质粒，在携带高容量外源基因上具有独特的魅力。亦可将宿主染色体基因保持1-2个低拷贝数转移至另一宿主细胞，并且维持基因的稳定。除此之外，miniF元件上含有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）和黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核耱基转移酶基因(xanthine guanine phosphoribosyi，XGPT)，有利于重组毒在荧光显微镜下挑斑纯化和压力培养基的筛选。
1材料与方法
1．1 菌株、质粒和培养基
大肠杆菌（E. coli）用（Luria-Bertani）LB液体培养，培养基中添加1%浓度的氨苄青霉素，氨苄青霉素（Ampcillin，Amp）50μg/mL。DEME培养基购自invitrogen公司；胰酶购自Difico公司。亲本毒HVT基因组由江苏省农科院国药中心保存。pUC19载体购自宝生物工程（大连）有限公司。
1．2 主要试剂和仪器
各种限制性内切酶（BamH I、Hind III、Sal I和EcoR I 等）、T4 DNA连接酶 、Taq DNA 聚合酶、LA Taq DNA 聚合酶, 均购自Takara公司。氨苄青霉素（(Ampcillin）为 Sigma公司产品。DNA胶回收试剂盒、DNA片段快速纯化试剂盒、质粒提取试剂盒等为大连TaKaRa有限公司产品。基因组提取试剂盒为Omega 公司产品。本实验所用引物由上海英骏公司合成。AIR TECH超净工作台；DK-80型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)；DYY-6C型及DYY-III2型电泳仪（北京六一仪器厂）；Gel Image System凝胶成像系统（Tanon 3600）；NIKON ECLIPSE TSl *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
00型倒置显微镜（NIKON，日本）；Milli-Q超纯水仪（Millipore公司，美国）；HERA cell C02细胞培养箱（Heraeus公司，德国）；梯度PCR仪（TaKeRa PCR Thermal Cycler Dice）；小型台式高速离心机（eppendorf Centrifuge 5424R）。
1．3 载体构建
为了构建含有miniF基因元件的转移载体pUC19-H1-miniF-H2，首先将pUC19酶切后导入同源臂H1获得pUC19-H1并分别进行PCR与酶切验证后，通过同样方法导入同源臂H2并进行PCR与酶切验证，最后同样将miniF导入复制非必须基因Us2区并验证后，将获得的pUC19-H1-miniF-H2保留备用[5]。
1．3．1 转移载体pUC19-H1-miniF-H2质粒的构建（下划线为酶切位点）
H1 上游引物序列 GTAGAATTCCAGTGTATGTTCCTTAGTGT
下游引物序列GATCCCGGGCTTTAATTAAGTTTCGATAGATGCGTAATATCG
H2 上游引物序列GGCGGGATCCAGTTAATTAAATCAGCACCATCGCATTGTT
下游引物序列 GACAAGCTTGAAATGTCTATGGTGTGATTGGA
1．4 鸡胚成纤维细胞的培养和传代
1．4．1 细胞培养
CEF的培养相对较容易，由于CEF的贴壁性较好，对培养器皿没有严格的要求，在此选择了细胞瓶与六孔板进行细胞培养。其次是培养基和培养介质的选择, 用于 CEF 的常用培养液有乳汉液、199培养液及DEME培养液等。在此选择了含有血清的DEME的培养基，因为血清中的生长因子对于成纤维细胞有较强的促有丝分裂作用, 并可通过诱导终末分化抑制上皮细胞的增殖[6]。
1．4．2 细胞传代
摘要：火鸡疱疹病毒miniF重组毒（HVT-miniF）的构建与纯化是获得火鸡疱疹病毒细菌人工染色体（HVT-BAC）过程中最重要的一步。本试验首先构建了含有HVT Us2位点上下同源臂miniF转移质粒载体，通过同源重组转染CEF细胞，将miniF元件插入到HVT基因组Us2非必需位点；然后通过荧光下挑斑纯化、破碎细胞释放病毒和霉酚酸压力筛选等方案，将重组毒HVT-miniF从亲本毒株中成功纯化出来，对构建火鸡疱疹病毒细菌人工染色体做好准备，为火鸡疱疹病毒活病毒载体基因工程疫苗的开发奠定基础。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
关键字:HVT-miniF；构建；纯化
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言（或绪论） 1
1 材料与方法 2
1．1 菌株、质粒和培养基 2
1．2 主要试剂和仪器 2
1．3 载体构建 2
1．4 鸡胚成纤维细胞的培养和传代 2
1．4．1 细胞培养 2
1．4．2 细胞传代 2
1．5 转移载体和HVT基因组的鸡胚CEF细胞转染 2
1．6 HVT-miniF重组毒的筛选与纯化 2
1．6．1 传代培养 3
1．6．2 挑斑纯化 3
1．6．3 超声破碎纯化 3
1．6．4 反复冻融纯化 3
2 结果与分析 3
2．1 转移载体pUC19-H1-miniF-H2质粒的构建和验证 3
2．1．1 pUC19-H1质粒的构建和验证 3
2．1．2 pUC19-H1-H2质粒的构建和验证 4
2．1．3 pUC19-H1-H2-miniF质粒的构建与验证 4
2．2 鸡胚成纤维细胞的培养和传代 4
2．3 转移载体和HVT基因组的鸡胚CEF细胞转染 5
2．4 HVT-miniF重组毒的筛选与纯化 5
2．4．1 荧光挑斑纯化 5
2．4．2 超声破碎后加压筛选 5
2．4．3 反复冻融后加压筛选 5
3 讨论 5
致谢 6
参考文献 7
火鸡疱疹病毒miniF重组毒的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
构建与纯化
动物医学学生 黄恺
引言
火鸡疱疹病毒(Herpesvirus of Turkey, HVT)是近年来研究开发并逐渐转向实际应用的一种新病毒载体, 与其它禽病毒载体相比具有许多优势:一方面安全性高，HVT病毒载体对家禽无致病性，还能很好的预防马立克疾病；另一方面免疫效果好，接种后病毒在鸡体内形成长达数周的病毒血症, 且终生潜伏感染,能刺激机体产生较高的抗体水平并维持终生, 从而抗体持续时间长。此外，HVT 基因组庞大, 非必需区域多，不但可以插入较长的外源基因,还可以插入多个不同的抗原片段用于构建多价或多联重组病毒活疫苗；HVT疫苗不仅生产成本低, 而且可以冻干，易于贮存和运输。目前, 国外已成功地利用HVT作为载体表达了多种禽病原保护性抗原基因, 展现了HVT作为载体疫苗的良好应用前景[1-3]。
由于HVT结构复杂，并且具有微强的细胞结合特性，使得以前在直核细胞中的同源重组操作技术对其进行操作和研究，显得费时费力困难重重。近年来，细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)技术在疱疹病毒上的应用解决了这一难题[4]。通过构建HVT-BAC，就可以在火肠杆菌中对HVT基因组进行遗传修饰。与在真核细胞中相比，在人肠杆菌中操作的重组技术具有更快速、有效、可靠的优点，尤其是最近发展起来的“Red/ET重组”技术在BAC修饰上的应用，更是促进了BAC技术的快速发展。
miniF是BAC质粒构建中的重要元件，它本是大肠杆菌的F性质粒，在携带高容量外源基因上具有独特的魅力。亦可将宿主染色体基因保持1-2个低拷贝数转移至另一宿主细胞，并且维持基因的稳定。除此之外，miniF元件上含有绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）和黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核耱基转移酶基因(xanthine guanine phosphoribosyi，XGPT)，有利于重组毒在荧光显微镜下挑斑纯化和压力培养基的筛选。
1材料与方法
1．1 菌株、质粒和培养基
大肠杆菌（E. coli）用（Luria-Bertani）LB液体培养，培养基中添加1%浓度的氨苄青霉素，氨苄青霉素（Ampcillin，Amp）50μg/mL。DEME培养基购自invitrogen公司；胰酶购自Difico公司。亲本毒HVT基因组由江苏省农科院国药中心保存。pUC19载体购自宝生物工程（大连）有限公司。
1．2 主要试剂和仪器
各种限制性内切酶（BamH I、Hind III、Sal I和EcoR I 等）、T4 DNA连接酶 、Taq DNA 聚合酶、LA Taq DNA 聚合酶, 均购自Takara公司。氨苄青霉素（(Ampcillin）为 Sigma公司产品。DNA胶回收试剂盒、DNA片段快速纯化试剂盒、质粒提取试剂盒等为大连TaKaRa有限公司产品。基因组提取试剂盒为Omega 公司产品。本实验所用引物由上海英骏公司合成。AIR TECH超净工作台；DK-80型电热恒温水槽(上海精宏实验设备有限公司)；DYY-6C型及DYY-III2型电泳仪（北京六一仪器厂）；Gel Image System凝胶成像系统（Tanon 3600）；NIKON ECLIPSE TSl *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
00型倒置显微镜（NIKON，日本）；Milli-Q超纯水仪（Millipore公司，美国）；HERA cell C02细胞培养箱（Heraeus公司，德国）；梯度PCR仪（TaKeRa PCR Thermal Cycler Dice）；小型台式高速离心机（eppendorf Centrifuge 5424R）。
1．3 载体构建
为了构建含有miniF基因元件的转移载体pUC19-H1-miniF-H2，首先将pUC19酶切后导入同源臂H1获得pUC19-H1并分别进行PCR与酶切验证后，通过同样方法导入同源臂H2并进行PCR与酶切验证，最后同样将miniF导入复制非必须基因Us2区并验证后，将获得的pUC19-H1-miniF-H2保留备用[5]。
1．3．1 转移载体pUC19-H1-miniF-H2质粒的构建（下划线为酶切位点）
H1 上游引物序列 GTAGAATTCCAGTGTATGTTCCTTAGTGT
下游引物序列GATCCCGGGCTTTAATTAAGTTTCGATAGATGCGTAATATCG
H2 上游引物序列GGCGGGATCCAGTTAATTAAATCAGCACCATCGCATTGTT
下游引物序列 GACAAGCTTGAAATGTCTATGGTGTGATTGGA
1．4 鸡胚成纤维细胞的培养和传代
1．4．1 细胞培养
CEF的培养相对较容易，由于CEF的贴壁性较好，对培养器皿没有严格的要求，在此选择了细胞瓶与六孔板进行细胞培养。其次是培养基和培养介质的选择, 用于 CEF 的常用培养液有乳汉液、199培养液及DEME培养液等。在此选择了含有血清的DEME的培养基，因为血清中的生长因子对于成纤维细胞有较强的促有丝分裂作用, 并可通过诱导终末分化抑制上皮细胞的增殖[6]。
1．4．2 细胞传代
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