内生真菌次生代谢产物的分离纯化及药理活性研究
：内生真菌因其与宿主之间在长期的共进化中，建立了稳定的互惠共生关系,也产生了各种各样对其自身及宿主具有重要作用的次生代谢产物，很多在免疫调节剂、酶抑制剂、抗代谢物质以及新型抗肿瘤物质有重要应用。因此对微生物次生代谢产物的研究不仅能让我们发现更多结构新颖的化合物，更有助于具有药理活性的化合物的发掘。本论文从正常的落叶松中分离筛选到一株真菌，对其进行发酵，对其次生代谢产物进行分离、纯化、鉴定及生物活性评价。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1仪器和试剂2
1.1.2培养基2
1.2方法 2
1.2.1菌种与发酵 2
1.2.2次生代谢产物的提取与分离 3
1.2.2化合物细胞毒活性测定方法 3
1.2.2化合物抗菌活性测定方法 3
2结果与分析 3
2.1化合物结构解析 3
2.2药理活性测试结果8
3讨论 10
致谢10
参考文献11
内生真菌次生代谢产物的分离纯化及生物活性研究
引言
传染病正在以前所未有的规模传播，非传染性疾病在老龄化人群中越来越普遍，病原菌的耐药性问题增长迅速[1]，正是由于这些棘手的难题新药研发才尤为紧迫。
从天然产物中筛选具有活性的成分或药物先导化合物是研究创制新药的有效途径之一[2]。在过去的半个世纪里，天然产物为医药行业提供了相当大的价值[16]。诸多文献[36]表明：天然产物或天然产物结构的发现在药物发展中将持续扮演着相当重要的角色。即使是在近几年，天然产物领域仍然产出或参与约50%的小分子药物[7]。
在地球上,那些人类肉眼不可见的微生物的种群和数量超乎我们想象的庞大。据估计,目前世界上仅有不到1% 的细菌和不到5% 的真菌被人们所认识，也就是意味着尚有数以亿万计的微生物有待人们去发现和研究[8]。微生物资源优点在于其的生物多样性、易于改造、生长周期短、代谢过程易控制、易大规模发酵等等，因此对其研究
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
、开发和利用似乎不存在“采伐过度”、“来源受限” 等问题。随着天然产物的发展，越来越多的天然药物化学家将其目光转向微生物次生代谢物[9]。微生物的次级代谢产物结构多样、活性广泛以及临床效果显著，其中许多化合物或其衍生物已经作为临床上治疗多种疾病的药物在广泛使用。
植物内生菌是指侵入植物组织内部生长，但不给宿主造成明显负效应的一类微生物[10]。 因其独特的生活环境以及与宿主植物之间的共进化，使其具有独特的次生代谢体系，理应可以产生具有各种生物活性，结构新颖的次生代谢产物。因此植物内生菌的次生代谢产物研究，日益成为研究热点[1115]。已发现内生菌对宿主植物至少有以下几个方面的有益作用：抗逆境（如干旱等）、促植物生长、固氮作用以及对抗食草动物及病原菌的侵袭等[17]。
由此看来，筛选出具有药用价值的活性物质或新型化合物可以从植物内生菌的次生代谢产物着手，这对于创制新药，解决自然资源的不足，开发紧缺和新型药物具有重要意义，将在很大程度上丰富人类的药物宝库。
天然的萘醌类化合物在自然界中广泛存在，并且被证实具有很好的抗菌、抗肿瘤的药理活性，有着天然、低毒、高效的优点。从真菌中分离得到的萘醌类化合物在萘醌类天然产物中占有很高的比例。本文从植物落叶松中分离到一株真菌，对其在改良马丁培养液中的发酵产物进行分离、纯化，共分到4个萘醌类（化合物1、2、4）及萘醌衍生物（化合物3）。其中一个为新的天然产物（化合物1），两个已知化合物（化合物2、3）药理活性已有文献报道，对抗菌、抗肿瘤及抑制黑色素有不同程度的作用。化合物1和4的药理活性尚在检测中。
1 材料与方法
1．1材料
1．1．1仪器和试剂
高压灭菌锅、镊子、电子天平、无菌纱布、接种针、滤纸、光照培养架、载玻片、盖玻片、加样枪、枪头（100 μL）、超净工作台、恒温培养箱、培养皿、酒精灯、恒温培养室、SUNRISE酶标仪、旋转蒸发仪EYELAN?1000、96孔微孔稀释板、水流抽气机A?3S、冷却水循环装置CA?1111。
质谱由Agilent 6210 LC/TOF MS 质谱仪测定。1H?和13C?NMR 由Bruker DPX?400或Bruker DRX?600核核磁共振仪测定（TMS为内标）。ODS硅胶来自日本京都Nacalai Tesque公司。层析柱硅胶（200?300目）为青岛海洋化工厂出品；Sephadex LH?20由瑞典Pharmacia Biotech制造；Hitachi pump L?7100和UV detector L?7400；TLC层析板（1020μm）为烟台江友硅胶开发公司制造的HSGF 254。 HPLC: Allsphere ODS?2.5 μm（250 × 4.6 mm）和Apollo C18?5μm（250 × 4.6 mm），所有试剂均为分析纯。
1．1．2 培养基
（1）马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）：去皮马铃薯200 g，切丁后加水煮沸25 min，纱布过滤。滤液加水至1000 mL；加入琼脂15?20 g，加热溶化后再加葡萄糖20 g，混匀、分装、121℃灭菌20 min后备用。
（2）改良马丁培养液：蛋白胨5 g，酵母膏2 g，蔗糖10 g，KH2PO41 g，MgSO4?7H2O 0.5 g，蒸馏水1000 mL ，分装，121℃灭菌20 min后备用。
1．2方法
1．2．1菌种与发酵
将采取的落叶松样品，去除表面的附着物，采用五步消毒法去除表面的微生物：
(1) 5% NaOCl溶液浸洗5 min；
(2) 2.5% Na2S2O3溶液浸洗10 min；
(3) 75%乙醇溶液浸洗5 min；
(4) 10% NaHCO3浸洗10 min；
无菌水冲洗3遍。将表面消毒后的植物用灭好菌的滤纸吸干，然后加入适量水进行充分研磨，然后吸取1 ml混合液与9 ml无菌水作为101，装入无菌EP管中。混合均匀后再从中吸取1 ml与9 ml无菌水作为102，每种浓度取200μl溶液涂布到分离培养基上，28℃培养13周。
挑取培养皿上长出的真菌,转接到纯化培养基PDA培养基上进行纯化培养3?5天，得到纯的菌株，准备进行大规模发酵。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1仪器和试剂2
1.1.2培养基2
1.2方法 2
1.2.1菌种与发酵 2
1.2.2次生代谢产物的提取与分离 3
1.2.2化合物细胞毒活性测定方法 3
1.2.2化合物抗菌活性测定方法 3
2结果与分析 3
2.1化合物结构解析 3
2.2药理活性测试结果8
3讨论 10
致谢10
参考文献11
内生真菌次生代谢产物的分离纯化及生物活性研究
引言
传染病正在以前所未有的规模传播，非传染性疾病在老龄化人群中越来越普遍，病原菌的耐药性问题增长迅速[1]，正是由于这些棘手的难题新药研发才尤为紧迫。
从天然产物中筛选具有活性的成分或药物先导化合物是研究创制新药的有效途径之一[2]。在过去的半个世纪里，天然产物为医药行业提供了相当大的价值[16]。诸多文献[36]表明：天然产物或天然产物结构的发现在药物发展中将持续扮演着相当重要的角色。即使是在近几年，天然产物领域仍然产出或参与约50%的小分子药物[7]。
在地球上,那些人类肉眼不可见的微生物的种群和数量超乎我们想象的庞大。据估计,目前世界上仅有不到1% 的细菌和不到5% 的真菌被人们所认识，也就是意味着尚有数以亿万计的微生物有待人们去发现和研究[8]。微生物资源优点在于其的生物多样性、易于改造、生长周期短、代谢过程易控制、易大规模发酵等等，因此对其研究
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
、开发和利用似乎不存在“采伐过度”、“来源受限” 等问题。随着天然产物的发展，越来越多的天然药物化学家将其目光转向微生物次生代谢物[9]。微生物的次级代谢产物结构多样、活性广泛以及临床效果显著，其中许多化合物或其衍生物已经作为临床上治疗多种疾病的药物在广泛使用。
植物内生菌是指侵入植物组织内部生长，但不给宿主造成明显负效应的一类微生物[10]。 因其独特的生活环境以及与宿主植物之间的共进化，使其具有独特的次生代谢体系，理应可以产生具有各种生物活性，结构新颖的次生代谢产物。因此植物内生菌的次生代谢产物研究，日益成为研究热点[1115]。已发现内生菌对宿主植物至少有以下几个方面的有益作用：抗逆境（如干旱等）、促植物生长、固氮作用以及对抗食草动物及病原菌的侵袭等[17]。
由此看来，筛选出具有药用价值的活性物质或新型化合物可以从植物内生菌的次生代谢产物着手，这对于创制新药，解决自然资源的不足，开发紧缺和新型药物具有重要意义，将在很大程度上丰富人类的药物宝库。
天然的萘醌类化合物在自然界中广泛存在，并且被证实具有很好的抗菌、抗肿瘤的药理活性，有着天然、低毒、高效的优点。从真菌中分离得到的萘醌类化合物在萘醌类天然产物中占有很高的比例。本文从植物落叶松中分离到一株真菌，对其在改良马丁培养液中的发酵产物进行分离、纯化，共分到4个萘醌类（化合物1、2、4）及萘醌衍生物（化合物3）。其中一个为新的天然产物（化合物1），两个已知化合物（化合物2、3）药理活性已有文献报道，对抗菌、抗肿瘤及抑制黑色素有不同程度的作用。化合物1和4的药理活性尚在检测中。
1 材料与方法
1．1材料
1．1．1仪器和试剂
高压灭菌锅、镊子、电子天平、无菌纱布、接种针、滤纸、光照培养架、载玻片、盖玻片、加样枪、枪头（100 μL）、超净工作台、恒温培养箱、培养皿、酒精灯、恒温培养室、SUNRISE酶标仪、旋转蒸发仪EYELAN?1000、96孔微孔稀释板、水流抽气机A?3S、冷却水循环装置CA?1111。
质谱由Agilent 6210 LC/TOF MS 质谱仪测定。1H?和13C?NMR 由Bruker DPX?400或Bruker DRX?600核核磁共振仪测定（TMS为内标）。ODS硅胶来自日本京都Nacalai Tesque公司。层析柱硅胶（200?300目）为青岛海洋化工厂出品；Sephadex LH?20由瑞典Pharmacia Biotech制造；Hitachi pump L?7100和UV detector L?7400；TLC层析板（1020μm）为烟台江友硅胶开发公司制造的HSGF 254。 HPLC: Allsphere ODS?2.5 μm（250 × 4.6 mm）和Apollo C18?5μm（250 × 4.6 mm），所有试剂均为分析纯。
1．1．2 培养基
（1）马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）：去皮马铃薯200 g，切丁后加水煮沸25 min，纱布过滤。滤液加水至1000 mL；加入琼脂15?20 g，加热溶化后再加葡萄糖20 g，混匀、分装、121℃灭菌20 min后备用。
（2）改良马丁培养液：蛋白胨5 g，酵母膏2 g，蔗糖10 g，KH2PO41 g，MgSO4?7H2O 0.5 g，蒸馏水1000 mL ，分装，121℃灭菌20 min后备用。
1．2方法
1．2．1菌种与发酵
将采取的落叶松样品，去除表面的附着物，采用五步消毒法去除表面的微生物：
(1) 5% NaOCl溶液浸洗5 min；
(2) 2.5% Na2S2O3溶液浸洗10 min；
(3) 75%乙醇溶液浸洗5 min；
(4) 10% NaHCO3浸洗10 min；
无菌水冲洗3遍。将表面消毒后的植物用灭好菌的滤纸吸干，然后加入适量水进行充分研磨，然后吸取1 ml混合液与9 ml无菌水作为101，装入无菌EP管中。混合均匀后再从中吸取1 ml与9 ml无菌水作为102，每种浓度取200μl溶液涂布到分离培养基上，28℃培养13周。
挑取培养皿上长出的真菌,转接到纯化培养基PDA培养基上进行纯化培养3?5天，得到纯的菌株，准备进行大规模发酵。
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