cullin9调控小鼠卵母细胞纺锤体组装和染色体排列的机制研究
Cullin9分子是p53相关蛋白复合物中的细胞质锚蛋白，能调控其定位及一系列后续的功能，并可能参与cullin-Ring E3泛素蛋白连接酶复合物的组成。Ring E3泛素蛋白连接酶是调节卵母细胞减数分裂成熟的关键分子，在纺锤体组装和染色体排列等生物学过程中发挥重要的作用。虽然Cullin9的功能在体细胞中研究比较广泛,但目前在生殖细胞中的研究还未见报道。本论文对小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中Cullin9的定位及其功能进行了研究，免疫荧光染色结果显示在GV期，Cullin9存在于细胞核中；从第一次减数分裂前中期至中期Cullin9与纺锤体共定位；从后期到末期Cullin9分布于纺锤体之间的区域；在第二次减数中期时Cullin9再次与纺锤体共定位。利用Cullin9特异的morpholino对其进行敲低可导致卵母细胞中纺锤体组装异常和染色体排列紊乱的发生率明显提高。与此同时，也显著增加了卵子非整倍体产生的几率。除此之外，结果还显示Cullin9可以调节卵母细胞中的Survivin的蛋白量，在Cullin9敲低组中Survivin的蛋白量明显增多。因此，Cullin9可能是通过控制Survivin的蛋白量来防止卵子非整倍体的产生。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1小鼠GV期卵母细胞的获得和体外培养 2
1.2 Cullin9基因的敲低 2
1.3免疫荧光染色 3
1.4免疫印迹 3
1.5数据处理3
2结果3
2.1 Cullin9在卵母细胞减数分裂成熟过程中的定位 4
2.2 敲低Cullin9影响卵母细胞中纺锤体组装和染色体排列 4
2.3 敲低Cullin9导致减数分裂过程中Survivin蛋白水平的升高5
3讨论 6
4结论 6
致谢6
参考文献6
Cullin9调控小鼠卵母细胞纺锤体组装和染色体排列的机制研究
引言
引言
在有丝分裂和减数分裂过程中，染色体的精确分离
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
能保证遗传物质的准确分配[1]。在哺乳动物中，卵母细胞减数分裂成熟是雌性动物产生单倍体配子的关键条件。在第一次减数分裂中期，同源染色体通过着丝粒连接在一起，而后被纺锤体牵引至至细胞相反的两极。在第二次减数分裂中期，两条姐妹染色单体分离后被纺锤体牵引至细胞的两极[2]。如果这些过程出现误差和错误将会导致非整倍体的产生，从而导致遗传疾病、发育缺陷和肿瘤形成[35]。
在有丝分裂和减数分裂过程中，染色体通过动粒与微管相连结。微管作为必要的细胞骨架多聚体，参与各种各样的生物学过程及细胞分裂过程[6]。微管是由α微管蛋白二聚体和β微管蛋白二聚体组成的柱形多聚体，非常活跃，在快速生长和收缩时期会交替出现[2, 79]。微管动力功能的破坏会损害很多细胞活动。除此之外，动粒和微管（KMT）之间的交换是随机并且很容易出错的过程[10]。因此，纺锤体组装检验点（SAC）作为监督机制可以抑制促后期复合物（APC）的激活直到所有染色体准确地与微管相连并且排列在中期赤道板上[1112]。
Cullin蛋白是CullinRing E3类泛素连接酶(CRLs家族)的组成成分，可通过参与多种蛋白的泛素化修饰来调节蛋白活性，在多种生物学过程中发挥重要作用。蛋白质泛素化修饰需要由三个酶(泛素激活酶、泛素转移酶和泛素连接酶)依次催化完成，其中泛素连接酶最为关键，它负责了底物的特异性识别和泛素化连接，其多样性保证了特定靶蛋白的功能调节[13]。高等真核生物体内存在1000多种E3泛素连接酶，其中CullinRing类E3连接酶占主体地位[14]。泛素化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式，E3泛素连接酶决定了泛素化过程的特异性。Cullin9 作为Cullin蛋白家族的一员含有多个功能区。Cullin9也是维持微管和基因组稳定性的必要因子，Survivin则是Cullin9的一种底物。早期研究表明，Cullin9是一种肿瘤抑制因子，Cullin9基因的缺失会导致肿瘤自发产生[7,15]，敲除Cullin9基因的肝细胞和胸腺细胞产生非整倍体的概率会显著增加[16]。
Cullin蛋白作为支架参与CRLs蛋白复合体的构成，在DNA复制、细胞周期、DNA损伤修复、肿瘤抑制、生长发育、信号转导、转录调节等过程发挥重要调节作用[17]。目前随着生殖系统的研究日渐增多，Cullin家族各成员已显示在配子发生和成熟、胚胎发育、生殖内分泌疾病及妇科肿瘤等生殖相关疾病中发挥着重要作用[18]。
Survivin是抑制凋亡的蛋白家族的一员，在细胞增殖中起到关键作用[19]，而Survivin的另一个重要作用就是调节微管的动态组装。研究表明，通过敲除、敲低或者注射Survivin抗体等方法降低Survivin表达量会导致微管的密度降低；相反，过表达Survivin能够使微管更稳定[20,21]。在有丝分裂中，Cullin9基因编码一种E3连接酶，定位在细胞胞质中。Cullin9的敲除小鼠在多个器官中会发生肿瘤，包括淋巴癌，以及在肺，肝脏和卵巢内发生的恶性肿瘤[22]。在维持微管和基因组完整性上，Survivin是Cullin9的下游因子。
虽然Cullin9参与了有丝分裂中众多关键的生物学过程，但其在卵母细胞减数分裂成熟过程中的作用尚未被研究清楚。本论文不仅对卵母细胞减数分裂过程中Cullin9的定位进行了观察，同时利用基因特异的morpholino敲低手段研究了其对纺锤体组装和染色体排列的影响，并发现其通过调节Survivin的蛋白水平来防止卵子非整倍体的产生。
一、材料与方法
1.1. 小鼠GV期卵母细胞的获得及体外培养
将小鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下迅速取出双侧卵巢，将卵巢剁成泥浆，然后立即加入M2培养液混匀置于体式显微镜下。用口吸管挑取形态较圆、透明带完整、卵质色泽均一、生发泡完整的GV期卵母细胞，取出的GV期卵母细胞在M2培养液中洗3遍，然后再放置于M16培养液中培养至特定的发育时期进行后续实验。
1.2. Cullin9的敲低
GV期卵母细胞在含有2.5uM米力农的M2培养液中显微注射510pl的对照或cullin9特异的morpholinos，其工作浓度为1mM。为了促使morpholino有效地抑制mRNA的翻译，注射后的GV卵母细胞置于含有2.5uM米力农的M16培养液中抑制发育20h，然后转移到不含米力农的M16中恢复减数分裂成熟。GV期卵母细胞培养8h和12h后在激光共聚焦显微镜下分别检测纺锤体构型、染色体排列和染色体数目。每组实验重复三次。
1.3. 免疫荧光染色
室温下卵母细胞在4%多聚甲醛中固定30分钟，转移到0.5% TritonX100透膜20分钟，然后再转移至含有1% BSA的 PBS中封闭1小时。在浓度为1:100的抗Cullin9一抗或1:200的抗αtubulinFITC抗体中4℃下孵育过夜。用含有1% Tween 20和 0.01% TritonX 100的PBS洗卵三遍，每遍2分钟。然后在荧光二抗中室温下孵育1小时。洗液洗三遍后，用PI 或 Hoechst 33342 (10 μg/ml)室温下染核10分钟。最后卵母细胞封在载玻片上，置于激光共聚焦显微镜下观察。
1.4. 免疫印迹
卵母细胞在含有蛋白酶抑制剂的4 X LDS上样液中95度加热5分钟。蛋白于12%的BisTris预制胶中分离，转移至PVDF膜上，在含有5%脱脂奶粉的TBST中室温封闭1小时，然后在1:1000稀释的一抗中4度孵育过夜。TBST中清洗3次（10分钟/次）后将膜在1:5000的HRP标记的二抗中室温孵育1小时。最后在化学发光剂ECL Plus中孵育5分钟，置于天能3900成像仪中曝光。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1小鼠GV期卵母细胞的获得和体外培养 2
1.2 Cullin9基因的敲低 2
1.3免疫荧光染色 3
1.4免疫印迹 3
1.5数据处理3
2结果3
2.1 Cullin9在卵母细胞减数分裂成熟过程中的定位 4
2.2 敲低Cullin9影响卵母细胞中纺锤体组装和染色体排列 4
2.3 敲低Cullin9导致减数分裂过程中Survivin蛋白水平的升高5
3讨论 6
4结论 6
致谢6
参考文献6
Cullin9调控小鼠卵母细胞纺锤体组装和染色体排列的机制研究
引言
引言
在有丝分裂和减数分裂过程中，染色体的精确分离
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
能保证遗传物质的准确分配[1]。在哺乳动物中，卵母细胞减数分裂成熟是雌性动物产生单倍体配子的关键条件。在第一次减数分裂中期，同源染色体通过着丝粒连接在一起，而后被纺锤体牵引至至细胞相反的两极。在第二次减数分裂中期，两条姐妹染色单体分离后被纺锤体牵引至细胞的两极[2]。如果这些过程出现误差和错误将会导致非整倍体的产生，从而导致遗传疾病、发育缺陷和肿瘤形成[35]。
在有丝分裂和减数分裂过程中，染色体通过动粒与微管相连结。微管作为必要的细胞骨架多聚体，参与各种各样的生物学过程及细胞分裂过程[6]。微管是由α微管蛋白二聚体和β微管蛋白二聚体组成的柱形多聚体，非常活跃，在快速生长和收缩时期会交替出现[2, 79]。微管动力功能的破坏会损害很多细胞活动。除此之外，动粒和微管（KMT）之间的交换是随机并且很容易出错的过程[10]。因此，纺锤体组装检验点（SAC）作为监督机制可以抑制促后期复合物（APC）的激活直到所有染色体准确地与微管相连并且排列在中期赤道板上[1112]。
Cullin蛋白是CullinRing E3类泛素连接酶(CRLs家族)的组成成分，可通过参与多种蛋白的泛素化修饰来调节蛋白活性，在多种生物学过程中发挥重要作用。蛋白质泛素化修饰需要由三个酶(泛素激活酶、泛素转移酶和泛素连接酶)依次催化完成，其中泛素连接酶最为关键，它负责了底物的特异性识别和泛素化连接，其多样性保证了特定靶蛋白的功能调节[13]。高等真核生物体内存在1000多种E3泛素连接酶，其中CullinRing类E3连接酶占主体地位[14]。泛素化是蛋白质翻译后修饰的一种重要方式，E3泛素连接酶决定了泛素化过程的特异性。Cullin9 作为Cullin蛋白家族的一员含有多个功能区。Cullin9也是维持微管和基因组稳定性的必要因子，Survivin则是Cullin9的一种底物。早期研究表明，Cullin9是一种肿瘤抑制因子，Cullin9基因的缺失会导致肿瘤自发产生[7,15]，敲除Cullin9基因的肝细胞和胸腺细胞产生非整倍体的概率会显著增加[16]。
Cullin蛋白作为支架参与CRLs蛋白复合体的构成，在DNA复制、细胞周期、DNA损伤修复、肿瘤抑制、生长发育、信号转导、转录调节等过程发挥重要调节作用[17]。目前随着生殖系统的研究日渐增多，Cullin家族各成员已显示在配子发生和成熟、胚胎发育、生殖内分泌疾病及妇科肿瘤等生殖相关疾病中发挥着重要作用[18]。
Survivin是抑制凋亡的蛋白家族的一员，在细胞增殖中起到关键作用[19]，而Survivin的另一个重要作用就是调节微管的动态组装。研究表明，通过敲除、敲低或者注射Survivin抗体等方法降低Survivin表达量会导致微管的密度降低；相反，过表达Survivin能够使微管更稳定[20,21]。在有丝分裂中，Cullin9基因编码一种E3连接酶，定位在细胞胞质中。Cullin9的敲除小鼠在多个器官中会发生肿瘤，包括淋巴癌，以及在肺，肝脏和卵巢内发生的恶性肿瘤[22]。在维持微管和基因组完整性上，Survivin是Cullin9的下游因子。
虽然Cullin9参与了有丝分裂中众多关键的生物学过程，但其在卵母细胞减数分裂成熟过程中的作用尚未被研究清楚。本论文不仅对卵母细胞减数分裂过程中Cullin9的定位进行了观察，同时利用基因特异的morpholino敲低手段研究了其对纺锤体组装和染色体排列的影响，并发现其通过调节Survivin的蛋白水平来防止卵子非整倍体的产生。
一、材料与方法
1.1. 小鼠GV期卵母细胞的获得及体外培养
将小鼠颈椎脱臼处死，无菌条件下迅速取出双侧卵巢，将卵巢剁成泥浆，然后立即加入M2培养液混匀置于体式显微镜下。用口吸管挑取形态较圆、透明带完整、卵质色泽均一、生发泡完整的GV期卵母细胞，取出的GV期卵母细胞在M2培养液中洗3遍，然后再放置于M16培养液中培养至特定的发育时期进行后续实验。
1.2. Cullin9的敲低
GV期卵母细胞在含有2.5uM米力农的M2培养液中显微注射510pl的对照或cullin9特异的morpholinos，其工作浓度为1mM。为了促使morpholino有效地抑制mRNA的翻译，注射后的GV卵母细胞置于含有2.5uM米力农的M16培养液中抑制发育20h，然后转移到不含米力农的M16中恢复减数分裂成熟。GV期卵母细胞培养8h和12h后在激光共聚焦显微镜下分别检测纺锤体构型、染色体排列和染色体数目。每组实验重复三次。
1.3. 免疫荧光染色
室温下卵母细胞在4%多聚甲醛中固定30分钟，转移到0.5% TritonX100透膜20分钟，然后再转移至含有1% BSA的 PBS中封闭1小时。在浓度为1:100的抗Cullin9一抗或1:200的抗αtubulinFITC抗体中4℃下孵育过夜。用含有1% Tween 20和 0.01% TritonX 100的PBS洗卵三遍，每遍2分钟。然后在荧光二抗中室温下孵育1小时。洗液洗三遍后，用PI 或 Hoechst 33342 (10 μg/ml)室温下染核10分钟。最后卵母细胞封在载玻片上，置于激光共聚焦显微镜下观察。
1.4. 免疫印迹
卵母细胞在含有蛋白酶抑制剂的4 X LDS上样液中95度加热5分钟。蛋白于12%的BisTris预制胶中分离，转移至PVDF膜上，在含有5%脱脂奶粉的TBST中室温封闭1小时，然后在1:1000稀释的一抗中4度孵育过夜。TBST中清洗3次（10分钟/次）后将膜在1:5000的HRP标记的二抗中室温孵育1小时。最后在化学发光剂ECL Plus中孵育5分钟，置于天能3900成像仪中曝光。
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