h9n2禽流感病毒感染小鼠隐窝细胞模型的建立
:小鼠肠道隐窝分离的Lgr5和肠道干细胞在体外细胞因子的刺激下能分化为绒毛和隐窝的肠黏膜类似结构，并且可以传代培养，称为肠道类器官（organoids），是研究病原微生物与肠黏膜相互作用理想模型。H9N2亚型禽流感病毒（AIV）能够存在消化道并且通过水禽粪便传播，也有感染人的报道。在这项研究中，我们利用小鼠肠道细胞探讨H9N2亚型禽流感病毒对肠黏膜的影响。在禽流感病毒感染48h后，荧光实时定量PCR可以检测到HA、NP在肠organoids模型中复制，并且表达明显升高，免疫荧光法进一步证实了其入侵的现象。此外，肠道干细胞标志物（Lgr5和Bmi1）在禽流感病毒感染48h后显著升高，提示感染禽流感病毒会引起干细胞的增殖。潘氏细胞（PCs）是位于小肠隐窝基底部的终末分化细胞，定量结果显示潘式细胞lyz1、defcr1和defa6表达下调。这些结果表明，禽流感病毒感染小鼠肠隐窝衍生的细胞通过诱导干细胞的增殖和潘氏细胞内容物的释放来维持上皮细胞稳态。
目录
摘要......3
关键词...3
Abstract......3
Key words3
引言.3
1材料与方法..................4
1.1试验材料及预处理......................4
1.1.1培养基及溶液配制 ..4
1.1.2 试验动物 .........4
1.1.3 试剂及耗材...4
1.1.4 主要仪器 .............5
1.2试验方法 5
1.2.1 分离、培养隐窝...............................................................................................................5
1.2.1.1肠道干细胞分离............................................................................................................ 5
1.2.
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
1.2隐窝细胞培养.................................................................................................................6
1.2.1.3隐窝细胞的鉴定.............................................................................................................6
1.2.2禽流感病毒接种隐窝细胞的建立. . 6
1.2. 2.1定量检测病毒的复制 ......................................................................6
1.2.2.2免疫荧光检测病毒表面蛋白 .......................................................................................6
1.2. 2.3定量检测organoids中潘氏细胞的变化..................................................................... 7
2 结果与分析.............................................................................................................................7
2.1 分离隐窝细胞................ ................ ................ .................................................................. 7
2.2 organoids模型的建立.................. . ..... .............................................................................. 8
2.3 AVI感染organoids模型的建立............................. .......................................................... 8
2.4 定量检测organoids感染AVI后潘氏细胞的变化...........................................................8
3 讨论.........................................................................................................................................9
致谢10
参考文献10
H9N2禽流感病毒感染小鼠隐窝细胞模型的建立
引言
禽流感（Avian influenza；AI）是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种禽类烈性传染病[1]，主要分为高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza，HPAI）和低致病性禽流感（Low pathogenic avian influenza，LPAI）。其中，低致病性禽流感病毒H9N2亚型致病力较低，在水禽（鸭）中通常不发病[2]。然而，该病毒可以在水禽尤其是鸭消化道内复制并持续通过粪便排毒，经粪水口途径传播给其他水禽，经野生水禽的迁移，再传播给其他陆生家禽和家畜[3]，所以该病毒在中东和远东地区常年存在。2013年，中国爆发的禽流感感染人的疫情，其主要病原为H7N9亚型，序列分析显示该病毒的六条基因来源于H9N2亚型禽流感病毒[4]，再次表明了H9N2亚型禽流感病毒的普遍存在，极大地提高了新型流感病毒变异重组的可能。但目前禽流感病毒的感染以及如何在肠道内复制和排毒的机制仍有待研究。
肠道上皮是一层单细胞层组织，由大量持续的隐窝绒毛（cryptvillus）单元组成，其中crypt为增殖区域，包括小肠干细胞（intestinal stem cells, ISCs）及其子代细胞，villus则是由各种终末分化细胞组成的分化区域[5]。相对于转化细胞和肿瘤细胞株，小肠类器官（organoids）是目前体外研究肠道上皮最好的工具，应用前景广泛。既往已有众多国内外学者 探讨了肠上皮细胞的原代培养问题，然而均无法做到长期体外培养以及维持原代细胞的分化能力。近期发现小鼠肠隐窝分离的Lgr5和ISCs在体外细胞因子的刺激下能分化为crypt和villus的肠黏膜类似结构，即小肠类器官，含有全部类型的小肠成熟细胞（肠干细胞、上皮吸收细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞和潘氏细胞），并且可以传代培养，能准确模拟肠道上皮生理情况[6]。通过小鼠肠干细胞标记分子、内分泌标记分子、杯状细胞和吸收细胞的免疫荧光标记，可以鉴别不同的细胞类型，提高了organoids作为细胞模型的可能性。鉴于H9N2流感病毒能够存在于消化道并且能够通过动物体内传播，那么在小鼠的organoids上复制流感病毒的模型，将比现有细胞系更符合生理环境，能够更好的研究禽流感病毒感染肠道上皮细胞的机制。
目录
摘要......3
关键词...3
Abstract......3
Key words3
引言.3
1材料与方法..................4
1.1试验材料及预处理......................4
1.1.1培养基及溶液配制 ..4
1.1.2 试验动物 .........4
1.1.3 试剂及耗材...4
1.1.4 主要仪器 .............5
1.2试验方法 5
1.2.1 分离、培养隐窝...............................................................................................................5
1.2.1.1肠道干细胞分离............................................................................................................ 5
1.2.
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1.2隐窝细胞培养.................................................................................................................6
1.2.1.3隐窝细胞的鉴定.............................................................................................................6
1.2.2禽流感病毒接种隐窝细胞的建立. . 6
1.2. 2.1定量检测病毒的复制 ......................................................................6
1.2.2.2免疫荧光检测病毒表面蛋白 .......................................................................................6
1.2. 2.3定量检测organoids中潘氏细胞的变化..................................................................... 7
2 结果与分析.............................................................................................................................7
2.1 分离隐窝细胞................ ................ ................ .................................................................. 7
2.2 organoids模型的建立.................. . ..... .............................................................................. 8
2.3 AVI感染organoids模型的建立............................. .......................................................... 8
2.4 定量检测organoids感染AVI后潘氏细胞的变化...........................................................8
3 讨论.........................................................................................................................................9
致谢10
参考文献10
H9N2禽流感病毒感染小鼠隐窝细胞模型的建立
引言
禽流感（Avian influenza；AI）是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种禽类烈性传染病[1]，主要分为高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza，HPAI）和低致病性禽流感（Low pathogenic avian influenza，LPAI）。其中，低致病性禽流感病毒H9N2亚型致病力较低，在水禽（鸭）中通常不发病[2]。然而，该病毒可以在水禽尤其是鸭消化道内复制并持续通过粪便排毒，经粪水口途径传播给其他水禽，经野生水禽的迁移，再传播给其他陆生家禽和家畜[3]，所以该病毒在中东和远东地区常年存在。2013年，中国爆发的禽流感感染人的疫情，其主要病原为H7N9亚型，序列分析显示该病毒的六条基因来源于H9N2亚型禽流感病毒[4]，再次表明了H9N2亚型禽流感病毒的普遍存在，极大地提高了新型流感病毒变异重组的可能。但目前禽流感病毒的感染以及如何在肠道内复制和排毒的机制仍有待研究。
肠道上皮是一层单细胞层组织，由大量持续的隐窝绒毛（cryptvillus）单元组成，其中crypt为增殖区域，包括小肠干细胞（intestinal stem cells, ISCs）及其子代细胞，villus则是由各种终末分化细胞组成的分化区域[5]。相对于转化细胞和肿瘤细胞株，小肠类器官（organoids）是目前体外研究肠道上皮最好的工具，应用前景广泛。既往已有众多国内外学者 探讨了肠上皮细胞的原代培养问题，然而均无法做到长期体外培养以及维持原代细胞的分化能力。近期发现小鼠肠隐窝分离的Lgr5和ISCs在体外细胞因子的刺激下能分化为crypt和villus的肠黏膜类似结构，即小肠类器官，含有全部类型的小肠成熟细胞（肠干细胞、上皮吸收细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞和潘氏细胞），并且可以传代培养，能准确模拟肠道上皮生理情况[6]。通过小鼠肠干细胞标记分子、内分泌标记分子、杯状细胞和吸收细胞的免疫荧光标记，可以鉴别不同的细胞类型，提高了organoids作为细胞模型的可能性。鉴于H9N2流感病毒能够存在于消化道并且能够通过动物体内传播，那么在小鼠的organoids上复制流感病毒的模型，将比现有细胞系更符合生理环境，能够更好的研究禽流感病毒感染肠道上皮细胞的机制。
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